結(jié)腸癌患者血清miR-125b 和miR-18b 的表達(dá)及臨床意義

苗金魚 何麗彩 劉 媛 王春艷 王敬然 丁秋蕾

1.石家莊市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000；2.河北省優(yōu)撫醫(yī)院外一科，河北石家莊 050000；3.石家莊市人民醫(yī)院腫瘤科，河北石家莊 050000

結(jié)腸癌是我國第二大癌癥，2020 年我國新確診結(jié)直腸癌患者55.5 萬例，死亡28.6 萬例，分別占我國全部癌癥的12.2%和9.5%[1]。近年來，早期結(jié)腸癌檢出率有所上升，但標(biāo)準(zhǔn)藥物治療仍存在局限，中晚期結(jié)腸癌患者生存率仍然較低[2-3]。及時(shí)判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后對早期采取相應(yīng)措施和延長生存時(shí)間意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小RNA 分子，通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。近年研究報(bào)道，miR-125b、miR-18b 在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移有關(guān)[5-6]。但關(guān)于二者在外周血循環(huán)中表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系尚無研究報(bào)道，本研究就此進(jìn)行分析，以期為結(jié)腸癌診治和預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2016 年8 月石家莊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的134 例結(jié)腸癌患者為結(jié)腸癌組，其中男71 例，女63 例；年齡41～78 歲，平均（60.54±12.54）歲；腫瘤直徑：52 例≥5 cm，82 例＜5 cm；分化程度：低分化28 例，中高分化106 例；TNM分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期87 例，Ⅲ～Ⅳ期47 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③患者及家屬知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腸道感染性疾病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病或其他部位惡性腫瘤；②免疫和血液系統(tǒng)疾病。另選取同期我院70 名體檢健康者為對照組，其中男37 名，女33 名；年齡26～78 歲，平均（60.68±11.57）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

采集患者入院后次日清晨和對照組體檢時(shí)空腹靜脈血，3000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），分離血清于-80℃冰箱中保存待測。TRIzol 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：2014007）提取血清總RNA，Takara 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20140844）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Narodrop 驗(yàn)證cDNA 濃度及純度，使吸光度（optical density，OD）260/OD280為1.8～2.0，使用伯樂CFX96 qRT-PCR 儀和qRT-PCR 試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，批號(hào)：20142522）進(jìn)行擴(kuò)增。miR-125b 正向引物：5’-TAAGGACAAAACGGGACTGG-3’，反向引物：5’-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3’；miR-18b 正向引物：5’-CTCGCTACGCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-ACGCTFCACGAATTTGCGAT-3’。反應(yīng)體系（20 μl）：1 μl cDNR、1 μl上游引物、2μl上游引物、10μl SYBR Green Master Mix、6 μl ddH2O；反應(yīng)條件：95℃30 s（1 個(gè)循環(huán)）、95℃15 s、62℃30 s、72℃20 s（40 個(gè)循環(huán)）。以U6（正向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，反向引物：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’）作為內(nèi)參校正。2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-125b、miR-18b 相對表達(dá)量。

1.3 隨訪

以患者出院日為起點(diǎn)，通過門診或電話隨訪5 年，隨訪截至2021 年8 月，記錄患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；K-M 法繪制不同miR-125b、miR-18b 表達(dá)結(jié)腸癌患者生存曲線，組間比較采用log-rank 檢驗(yàn)；受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)對結(jié)腸癌預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)水平比較

結(jié)腸癌組血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)為（0.828±0.201）、（1.205±0.166），對照組為（1.442±0.305）、（0.617±0.131）。結(jié)腸癌組血清miR-125b 表達(dá)水平低于對照組，miR-18b 表達(dá)水平高于對照組（t=15.194、25.749，P ＜0.001）。

2.2 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)的關(guān)系

不同TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-125b和miR-18b 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者血清miR-125b 和miR-18b 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)的關(guān)系（）

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)的關(guān)系（）

2.3 血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)與結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)系

隨訪3～60 個(gè)月，中位時(shí)間36.50（17.75，49.00）個(gè)月，134 例結(jié)腸癌患者死亡52 例，總生存率為61.19%（82/134）。以血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)均值為基準(zhǔn)分為高低表達(dá)組，miR-125b 高表達(dá)組總生存率為77.61%（52/67），中位生存期為38.00（21.00，52.00）個(gè)月；低表達(dá)組總生存率為44.78%（30/67），中位生存期為33.00（16.00，45.00）個(gè)月。miR-18b 高表達(dá)組總生存率為41.79%（28/61），中位生存期為33.00（16.50，44.50）個(gè)月；低表達(dá)組總生存率為73.97%（54/73），中位生存期為38.00（20.50，51.50）個(gè)月。K-M 曲線顯示，miR-125b 高表達(dá)組總生存率高于miR-125b 低表達(dá)組（log-rank χ2=15.601，P ＜0.001）；miR-18b 高表達(dá)組總生存率低于miR-18b 低表達(dá)組（log-rank χ2=12.047，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 不同血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)結(jié)腸癌患者生存曲線

2.4 血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)對結(jié)腸癌預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值

ROC 曲線顯示，血清miR-125b 與miR-18b 聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后不良的AUC 值大于miR-125b、miR-18b 單獨(dú)預(yù)測（P ＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后不良的ROC 曲線

表2 血清miR-125b、miR-18b 表達(dá)對結(jié)腸癌預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，大多患者確診時(shí)已為晚期，失去手術(shù)根治時(shí)機(jī)[8-9]。盡管近年術(shù)后化療、放療、靶向治療等手段取得一定效果，但結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力和耐藥性強(qiáng)，超過1/3 的結(jié)腸癌患者在術(shù)后會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性患者5 年生存率僅為10%[10]。

表觀遺傳學(xué)在腫瘤中發(fā)揮重要作用[11]。miRNA 是表觀遺傳學(xué)的重要一環(huán)，可通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA 的蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控靶基因的表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。如miR-101 能靶向Zeste 同源物2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移[14]，miR-200c能靶向程序性死亡蛋白配體1 基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。miR-125b 的兩個(gè)前體為miR-125b-1 和miR-125b-2，分別位于染色體11q24.1 和21q21.1。早期研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，如許偉先等[16]研究報(bào)道，上調(diào)胰腺癌細(xì)胞和組織中miR-125b 表達(dá)，能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移。洪理泉等[17]研究報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞中miR-125b 表達(dá)下調(diào)，能靶向結(jié)合ETV63’UTR 調(diào)控Hs578T 細(xì)胞，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。提示miR-125b 在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-125b 表達(dá)降低，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-125b 低表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸癌惡性進(jìn)展。其機(jī)制可能與miR-125b 靶向抑制髓細(xì)胞白血病基因-1（myeloid cell leukemin-1，Mcl-1）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3）有關(guān)。Mcl-1 是一種凋亡調(diào)控基因，能通過維持線粒體膜穩(wěn)定，抑制細(xì)胞色素C 釋放，阻止癌細(xì)胞凋亡[18]。STAT3 為細(xì)胞信號(hào)和轉(zhuǎn)錄激活的重要激活因子，能通過激活Janus 激酶/STAT 信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖、分化[19]。研究表明，上調(diào)miR-125b 表達(dá)能靶向抑制Mcl-1 和STAT3 表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及促進(jìn)凋亡[5,20]。通過繪制結(jié)腸癌患者5 年生存曲線發(fā)現(xiàn)，miR-125b 高表達(dá)組5 年總生存率顯著升高，提示miR-125b 低表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，可能成為預(yù)后分子標(biāo)志物。

miR-18b 位于染色體Xq26.2，早期研究多報(bào)道其與氧化應(yīng)激的關(guān)系[21]。miR-18b 在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，能靶向Kruppel 樣因子6 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[22]。Yang 等[23]研究顯示，miR-18b 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，能靶向核仁紡錘體相關(guān)蛋白-1 抑制肝癌細(xì)胞增殖。說明miR-18b 也在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-18b 表達(dá)升高，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-18b 高表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸癌惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-18b 能靶向上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase 2 inhibitor B，CDK2B）有關(guān)。CDK2B 是一種促癌基因，位于多種腫瘤中經(jīng)常突變和缺失的區(qū)域，促進(jìn)癌細(xì)胞生長和周期進(jìn)展[24-25]。研究報(bào)道，沉默miR-18b 表達(dá)能抑制CDK2B 表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移[6]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-18b 高表達(dá)組5 年總生存率顯著降低，說明miR-18b 高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，可能成為預(yù)后分子標(biāo)志物。ROC 曲線結(jié)果顯示，血清miR-125b、miR-18b 均能作為結(jié)腸癌預(yù)后不良指標(biāo)，且兩指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后不良的AUC 較單獨(dú)預(yù)測顯著增加，提示聯(lián)合檢測血清miR-125b、miR-18b 能提升對結(jié)腸癌預(yù)后不良預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清miR-125b 表達(dá)降低，miR-18b 表達(dá)升高，與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為預(yù)后不良預(yù)測指標(biāo)。但本研究結(jié)果還需多中心大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證，并深入研究miR-125b、miR-18b 影響結(jié)腸癌預(yù)后的機(jī)制。