紅景天苷調節CLP誘導的膿毒癥小鼠肺纖維化及JAK2/STAT3的活化①

虢 強 朱美意 張 杰 許 杰 郭友祥 （石河子大學醫學院第一附屬醫院急診外科，石河子 832008）

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應綜合征，常見于嚴重創傷、多發傷和外科手術后的患者，按嚴重程度可分為膿毒癥、嚴重膿毒癥和膿毒癥休克。據國外流行病學調查顯示，全球膿毒癥病死率高達30%～70%，由于膿毒癥治療費用昂貴，醫療資源消耗大，嚴重影響人類生命健康和生活質量［1-3］。目前，臨床上針對膿毒癥的治療方法主要有液體復蘇和抗生素治療等［4］。研究表明，膿毒癥發病機制與全身性炎癥反應、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷及外來感染源相關，與多系統、多器官的病理生理改變緊密聯系，而肺臟是膿毒癥并發癥中損傷最嚴重的器官之一，膿毒癥發生時，大量炎癥因子和炎癥介質的釋放和活化，導致機體抗炎和促炎因子失衡，免疫功能受損，從而促進急性肺損傷的發生發展過程［5-6］。紅景天苷是紅景天根的活性成分，具有抗衰老、抗炎、免疫調節和抗氧化等藥理作用。本實驗旨在通過盲腸結扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）誘導膿毒癥小鼠模型，探究紅景天苷對膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥和JAK2/STAT3磷酸化的影響，為紅景天苷在膿毒癥中的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 紅景天苷（純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司（CAS10338-51-9）；HE試劑盒、Masson試劑盒和ELISA試劑盒均購自美國Sigma 公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）、Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、IL-4、IL-6、IL-10、JAK2、STAT3和GAPDH兔單克隆單體及HRP標記的對應二抗均購自美國Abcam 公司。動物肺功能檢測儀（上海塔望智能科技有限公司，PFT-MR）；光學顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100）；脫色搖床（Servicebio，TSY-B）；掌上離心機（Servicebio，MX-F）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）；組織攤片機（浙江金華市科迪儀器設備有限公司）；移液 槍（Dragon，KE0003087/KA0056573）；酶 標 儀（Rayto，RT-6100）；臺式高速離心機（DRAGONLAB，D3024R）。

1.1.2 動物分組、建模及給藥 50只清潔級BALB/c小鼠（雄雌不限，體質量20～25 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號：SYXK（京）2017-0033。動物飼養條件：每只小鼠給予24 h 晝夜燈光照射控制及嚴格、規范的卡片登記管理，24 ℃條件下獨立飼養，建模前24 h 小鼠禁食不禁水。將小鼠分為健康對照組、模型組、模型+5 mg/kg紅景天苷組、模型+10 mg/kg 紅景天苷組、模型+20 mg/kg 紅景天苷組（n=10）。模型加藥組小鼠參照文獻［7］分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 紅景天苷，1 h 后模型組和模型加藥組小鼠參照文獻［8］采用CLP 建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉小鼠，腹部消毒后正中開腹，絲線結扎盲腸的根部，用無菌絲線結扎盲腸遠端1.5～1.8 cm 處，用18 號無菌針頭在已經結扎的盲腸遠端中央處貫通穿刺，擠出少量內容物后將盲腸原位推回至腹腔并縫合切口，健康對照組只開腹、關腹并復蘇，不進行CLP。術后10 h取血并處死大鼠，收集小鼠肺組織，組織清洗后部分組織置于4%多聚甲醛中固定用于染色實驗，剩余組織置于液氮中保存用于分子實驗。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢測 取4%多聚甲醛固定的肺組織，按試劑盒說明書進行HE 染色。石蠟包埋組織并切片，組織切片厚4 μm，將切片清洗后浸入二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液中30 min，用無水乙醇脫水處理。然后進行蘇木精-伊紅染色，最后用二甲苯和乙醇進行透明，中性樹脂封片，隨機選取10個視野在顯微鏡下觀察拍照，并記錄組織病理變化。胞核呈藍紫色，胞質呈紅色。參照文獻［9］對各組小鼠進行肺組織損傷評分，評分標準包括間質水腫、肺泡水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡出血和肺泡結果完整性破壞等項目，0分：無肺損傷；0.25～2.5分；輕度或中度肺損傷：2.6～4 分：嚴重肺損傷，40 倍顯微鏡下，每組隨機選取10 個視野進行肺損傷評分，結果取平均值，肺損傷評分越高表示損傷程度越嚴重。采用干濕重法測定各組小鼠肺組織濕干重比值（W/D），取小鼠右肺下葉用4%多聚甲醛固定后稱取濕重，然后置于70 ℃烘箱中烘干72 h 后稱取干重，計算肺組織W/D，利用動物肺功能檢測儀檢測各組小鼠肺靜息通氣量。

1.2.2 Masson 染色觀察肺纖維化 取4%多聚甲醛固定的肺組織，石蠟包埋組織并切片，脫蠟水洗處理步驟同1.2.1，經Masson染色后，用二甲苯和無水乙醇透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察拍照并記錄分析，胞質、肌纖維、紅細胞和纖維素呈橙紅色，胞核呈藍褐色，膠原纖維被染成藍色。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達水平 液氮中取出肺組織，自然解凍后用手術剪將組織剪成組織小塊并置于研磨儀中研磨均勻。采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取組織總蛋白，4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min 后取上清，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白總濃度，每孔上樣20 μg，經SDS-PAGE 電泳分離、轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，次日回收一抗，加入HRP標記的二抗（1∶10 000），室溫下搖床孵育2 h 后，采用ECL化學發光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片整理去色并存檔，分別與GAPDH 蛋白灰度值比值計算蛋白的相對表達量。獨立重復實驗3次取平均值。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子含量 嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定外周血中iNOS、IL-4、IL-6、IL-10含量。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0 軟件分析，正態分布的計量資料表示為±s。多組數據比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷對膿毒癥小鼠肺功能的影響 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理損傷程度，健康對照組小鼠肺組織結構正常，肺泡腔清晰可見，肺泡間間隔無水腫和炎癥浸潤。與健康對照組相比，模型組小鼠肺組織結構紊亂，無完整的肺泡結構，可見大量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結構無明顯變化，10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織結構趨于正常，可見完整的肺泡結構，肺泡間質僅見少量炎癥細胞浸潤。顯微鏡下隨機選取10 個視野對各組小鼠進行肺組織病理損傷評分，結果取平均值，同時檢測肺功能指標水平，與健康對照組相比，模型組小鼠肺損傷評分、肺組織W/D 顯著升高，肺靜息通氣量顯著減少（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評分、肺組織W/D 和肺靜息通氣量差異均無統計學意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評分和肺組織W/D 降低，肺靜息通氣量增多，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖1。提示紅景天苷能夠改善CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織病理損傷。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色及肺功能檢測（HE，×400）Fig.1 HE staining and pulmonary function test of lung tissue of mice in each group（HE，×400）

2.2 紅景天苷對膿毒癥小鼠肺組織纖維化的影響 如圖2所示，健康對照組小鼠肺組織結構完整，未見藍色的膠原纖維。與健康對照組相比，模型組小鼠肺組織結構紊亂，可見大量藍色膠原纖維和組織損傷。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織纖維化程度無明顯差異，10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結構完整，可見少量的藍色膠原纖維。提示紅景天苷可減輕CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

圖2 小鼠肺組織Masson染色圖（×400）Fig.2 Masson staining image of mice lung tissue（×400）

2.3 紅景天苷對膿毒癥小鼠肺組織纖維化蛋白水平的影響 與健康對照組相比，模型組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin、ColⅠ蛋白水平均顯著上調（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平差異均無統計學意義（P>0.05），10 mg/kg和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平均顯著下調（P<0.05），見圖3。提示紅景天苷能夠抑制CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

圖3 小鼠肺組織纖維標志蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of fibrous marker proteins in mice lung tissue

2.4 紅景天苷對膿毒癥小鼠炎癥因子含量的影響 與健康對照組相比，模型組小鼠肺組織中誘導型iNOS、IL-6、IL-4 和IL-10 含量均顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠炎癥因子水平差異無統計學意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中iNOS、IL-6 水平顯著降低，IL-4 和IL-10 水平顯著升高（P<0.05），見圖4。提示紅景天苷可能通過調節CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織炎癥因子水平緩解肺損傷。

圖4 小鼠肺組織炎癥因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factors in mice lung tissue

2.5 紅景天苷對膿毒癥小鼠肺組織JAK2和STAT3磷酸化的影響 如圖5所示，與健康對照組相比，模型組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著上調（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平差異均無統計學意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平均顯著下調（P<0.05）。提示紅景天苷可能通過JAK2/STAT3 信號通路調節CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺纖維化和炎癥。

圖5 小鼠肺組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 in mice lung tissue

3 討論

研究表明，紅景天苷在急性肺損傷中具有保護作用，如紅景天苷通過上調SIRT1 表達抑制NF-κB和HMGB1 通路的活化，緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺損傷和炎癥反應［10］。紅景天苷通過調節肺上皮細胞中miRNA-146 外泌體的分泌抑制脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠炎癥反應，還可通過抑制NF-κB 磷酸化保護急性肺損傷大鼠肺損傷等［11-12］。本研究結果顯示，經紅景天苷給藥治療后，CLP誘導的膿毒癥小鼠肺損傷得到顯著改善，肺功能明顯好轉。提示紅景天苷在膿毒癥小鼠肺損傷中具有保護作用。

肺纖維化是指成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴隨炎癥損傷、組織結構破壞等的一系列病理變化［13-14］。α-SMA 是肌成纖維細胞增殖、分化及膠原蛋白形成的標志蛋白。FN 是細胞外基質糖蛋白成分，是成纖維細胞的活化因子，與肺纖維化密切相關。Vimentin 是中間絲中的一種蛋白質，為微管和肌動蛋白提供彈性，是維持細胞骨架完整性的重要蛋白。ColⅠ是上皮細胞活化、膠原酶形成及骨結構完整性的膠原蛋白。張翠影等［15］發現，α-SMA、FN、ColⅠ在急性肺損傷小鼠肺組織中的高表達與肺纖維化和肺損傷呈正相關。本實驗結果顯示，經紅景天苷治療后，膿毒癥小鼠肺纖維化程度明顯改善，α-SMA、FN、Vimentin和ColⅠ蛋白表達水平顯著降低，且20 mg/kg紅景天苷治療效果最佳，此結果與張翠影等［15］的研究結果相符，說明紅景天苷對CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺纖維化具有抑制作用。

肺部炎癥和免疫功能障礙是膿毒癥小鼠肺功能損傷的主要因素，膿毒癥發生時，炎癥因子和免疫因子大量釋放，導致肺組織發生免疫失調和過度炎癥反應，從而發生急性肺損傷［16］。iNOS、IL-4、IL-6、IL-10 是重要的炎癥和免疫調節因子，iNOS 和IL-6在炎癥反應中促進炎癥發生，而IL-4和IL-10是炎癥和免疫抑制因子［17-19］。本研究結果顯示，經紅景天苷給藥治療后，膿毒癥小鼠肺組織中iNOS、IL-6 含量顯著降低，IL-4 和IL-10 含量顯著升高，結果提示紅景天苷通過調節CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織中炎癥因子水平緩解小鼠肺損傷。

為進一步明確紅景天苷調節膿毒癥小鼠肺組織纖維化和炎癥的作用機制，課題組檢測了JAK2和STAT3的磷酸化水平，JAK2是非受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員，STAT3 是信號傳導和轉錄激活因子，JAK2/STAT3 信號通路在細胞增殖、分化和免疫調節等生物學過程中發揮重要作用［20］。當機體受外界炎癥因子刺激時，胞外信號蛋白與膜上受體結合并激活JAK2，活化的JAK2 使受體多位點酪氨酸殘基磷酸化，吸引STAT3 與受體結合并磷酸化，磷酸化的JAK2誘導p-STAT3二聚體化或異二聚體化，并從復合物上脫離易位至細胞核內，與相應的反應元件結合，最后介導目的基因和炎癥因子的表達，炎癥因子又激活JAK2/STAT3 通路加重機體組織損傷［21］。王國全等［22］發現，膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中高表達JAK2 和STAT3，本實驗結果顯示，CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織中高表達p-JAK2 和p-STAT3，經紅景天苷治療后，膿毒癥小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 表達水平顯著降低。結合前期結果提示，紅景天苷通過下調JAK2 和STAT3 表達抑制CLP誘導的膿毒癥小鼠肺炎癥反應。

綜上所述，紅景天苷對CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥具有保護作用，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。