絕經后骨質疏松患者骨組織中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p的表達

牟朋林，麥彩園，曹燕明，王 斌 (.廣州新海醫(yī)院，廣東 廣州 50080；.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 5000；.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 5060；.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 5800)

骨質疏松癥(OP)是常見的代謝性骨疾病，其特點為骨量及質量、骨強度下降[1]。當前我國骨質疏松癥患者數(shù)量超過了7 000萬，50歲以上女性患病率為20.7%[2]，OP在絕經后婦女的發(fā)病率為未絕經女性的2～3倍[3]。OP的發(fā)病率逐年升高，已經成為世界范圍內重大的健康-經濟-社會問題[4]。破骨細胞(OC)和成骨細胞(OB)使骨骼處于重塑狀態(tài)并維持正常的結構與功能[5]，它們維持的平衡被打破時骨構建功能會異常，骨質疏松或骨代謝疾病等將發(fā)生[6]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白單鏈小分子RNA，已經在腫瘤、骨代謝等多個領域被廣泛研究[7]。miRNA主要通過與靶基因的3'端非編碼區(qū)結合，對靶因子產生負性調控作用，導致其降解或停止翻譯，從而影響細胞的增殖、遷移、凋亡[8]。miRNA是可以調控骨髓間充質干細胞(BMSCs)向OB分化的，其對骨質疏松等相關疾病的治療有重要價值[9]。史宏利等[10]分析證實miR-124-3p對BMSCs向OB的分化起調控作用。研究表明miR-328-3p、miR-338-3p可作為絕經后骨質疏松發(fā)生的生物標志物[11]。近年來，miRNA在MSCs及成骨與破骨中的生物作用越來越受到廣泛的關注。本研究通過RT-qPCR方法分析檢測骨組織中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在絕經后骨質疏松(PMOP)中的表達。

1 資料與方法

1.1研究對象及受試基本條件：本研究選擇2020年1月～2021年9月在廣州新海醫(yī)院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院招募的絕經后婦女60例，分為對照組30例和PMOP組30例。患者傷前活動能力、完全民事行為能力正常，無精神及認知障礙，同意為本研究受試者，并且簽署知情同意書等相關事項。本研究符合人體相關倫理學標準，并得到廣州新海醫(yī)院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會的批準。入院后登記姓名、年齡、身高、體重等各項資料，所有受試者檢測骨密度(BMD)及T值，骨轉換標志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25-羥維生素D[25(OH)D]， 雌二醇。

1.2入組標準

1.2.1PMOP組入組標準：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測骨密度T值≤-2.5，診斷為PMOP。

1.2.2對照組入組標準：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測骨密度T值≥-1.0。

1.2.3排除標準：伴有嚴重慢性疾病；引起繼發(fā)性PMOP的內分泌性等代謝異常的疾病; 1年內接受藥物或者激素治療；有血液系統(tǒng)疾病不能行髂前上棘骨穿刺術；難以行髂前上棘骨穿刺術取到標本。

1.3標本收集：所有受試者行髂前上棘骨穿刺術，取松質骨骨組織≥300 mg，保存于液氮中，再轉深低溫冰箱(-80℃)中保存。采集空腹下外周靜脈血，離心后血清放入深低溫冰箱內保存。

1.4方法

1.4.1主要儀器及試劑：紫外分光光度計、PCR 儀、熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、引物(中國Takara公司)。

1.4.2RT-qPCR過程：①取骨樣品：錘擊，加液氮研磨，勻漿，移至1 ml RNAiso Plus液的EP管，混勻，加入氯仿0.2 ml，混勻，15～30℃孵育5 min。4℃下離心15 min，將上層水相移至無RNA酶離心管中，加異丙醇，孵育10 min，于4℃下離心10 min。移去上清液，加入1 ml的75%乙醇，混勻，4℃下離心5 min后棄去上清，室溫干燥10 min。加入無RNA酶水40 μl獲得RNA溶液，用DEPC水做空白標記，光度計檢測讀取OD比值介于1.9～2.0之間。②參照反轉錄試劑盒反轉錄將RNA合成cDNA：參照PCR試劑盒操作進行，在熒光定量PCR儀(Takara)上進行PCR反應。用Primer Premier5.0軟件設計、Takara公司合成的引物(序列見表1)，反應體系:TaqMan?Fast Advanced Master Mix(2×)10 μl,TaqMan? Advanced miRNA Assay(20×)1 μl,cDNA反應液(1∶10 dilution)5 μl，Nuelease-free water 4 μl。按以下反應程度反應條件進行擴增：95℃預變性20 s；95℃ 1 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)。選擇U6做內參基因，使用qPCR儀自帶Rotor-Gene Q Software進行計算所有樣品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOP組因子相比對照組因子表達變化的相對表達量。

表1 引物序列表

2 結果

2.1兩組人群一般資料比較：兩組人群年齡、身高、體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；PMOP組患者BMD低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而對照組T值>-1.0，PMOP組T值<-2.5，符合分組的規(guī)律。見表2。

表2 兩組人群一般資料比較

2.2兩組人群骨轉換標志物比較：兩組β-CTX、PINP、雌二醇差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；N-MID-OT、25(OH)D比較差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。符合以上指標在對照組、PMOP組的水平變化。見表3。

表3 兩組人群骨轉換標志物比較

2.3兩組人群骨組織中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p水平比較：PMOP組患者骨組織中的miR-124-3p、miR-338-3p表達水平高于對照組，miR-328-3p表達水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組人群骨組織中的miRNA的相對表達值水平比較

3 討論

PMOP是由于女性絕經后體內雌激素水平迅速下降，OC導致的骨吸收大大增加，而OB未相應增加，導致骨吸收大于骨形成引起的代謝性疾病[12]。miRNA作為一種具有調控功能的非編碼單鏈RNA大量存在于MSCs內，影響成骨、破骨細胞的增殖、遷移和分化等多種生物學功能過程[13]。近年來，miRNA對BMSCs分化及對OB、OC的影響已成為熱點問題,miR-124-3p、miR-328-3p、miR-328-3p在PMOP調控成骨和破骨中發(fā)揮一定的作用[9-10,12]。

Qadir等[14]發(fā)現(xiàn)在人BMSCs的分化過程中miR-124-3p的表達改變可能影響了BMSCs的生物學功能。miR-124-3p通過抑制GSK-3β/β-catenin信號通路促進糖尿病骨質疏松大鼠骨髓間質成骨[15]，RANKL降低破骨細胞形成過程中miR-124的表達，miR-124降低破骨細胞前體的增殖和活力[16]。低骨量患者中血清miR-124-3p的增高可反映骨組織對絕經所致骨丟失的代償機制-誘導骨丟失，促進成骨細胞分化[17]。有研究及數(shù)據(jù)庫表明miR-124-3p在成骨中的作用靶點可能與Wnt信號通路有關，其中的Frizzled、LRP5/6、GSK-3β、Axin為可能的預測靶點[10,18-20]。本研究通過RT-qPCR方法分析檢測miR-124-3p在PMOP組骨組織中的表達水平降低，說明其可通過減弱破骨、增強成骨促進PMOP。miR-124-3p可能通過某些靶點調控絕經后骨質疏松成骨、破骨分化，其作用靶點可能與Wnt信號通路的相關成骨因子、破骨RANKL因子有關。

Weilner等[21]研究表明miR-328-3p在骨質疏松性骨折患者血清中顯著下降，ROC曲線分析顯示了它具有較好的診斷價值，miR-328-3p可作為PMOP發(fā)生的生物標志物，其研究在脂肪來源的BMSCs中敲除miR-328-3p后，明顯能抑制ALP活性和礦化能力，但其靶因子及具體機制不清。有研究[15]分析MSCs能夠通過整合素吞噬凋亡小體，并利用凋亡小體來源的泛素連接酶RNF146和miR-328-3p來抑制Wnt通路的因子Axin1。缺乏凋亡的MSCs能夠同時從外源凋亡小體中吞噬RN F146和miR-328-3p并阻斷Axin1，從而影響Wnt通路。凋亡小體還轉移miR-328-3p下調MRL/lpr MSC中Axin1的表達，而敲除miR-328-3p，但不包括其他Axin靶向微RNA，能部分廢除凋亡小體的作用——對BMSCs功能受損可以起到相關作用。凋亡小體將E3連接酶RNF146和miR-328-3p轉移到MSCs中的Axin1靶點并激活Wnt/β-catenin通路從而減少受損干細胞。Delic等[22]發(fā)現(xiàn)miR-328-3p能直接靶向Wnt抑制蛋白SFRP1從而激活Wnt通路，促進膠質細胞瘤侵襲能力，而研究表明SFRP1蛋白對OB和OC的分化均有調控作用，是調控骨重建的一個重要因子[23-24]。Ishimoto等[25]發(fā)現(xiàn)CD44是miR-328-3p的一個靶因子，有研究敲除CD44能顯著抑制OC活性[26]。本研究通過RT-qPCR方法分析檢測miR-328-3p在PMOP組骨組織中的表達水平降低，其可能通過某些靶點調控絕經后骨質疏松成骨、破骨分化，其作用靶點可能與Wnt信號通路的相關因子、凋亡小體與BMSCs的相互作用有關。

研究顯示在OP中miR-338-3p 可以通過靶向于RANKL，從而抑制糖皮質激素誘導破骨細胞生成[27]。miR-338-3p 通過靶向作用Runx2負向調控BMSCs成骨分化,從而引起骨質疏松的發(fā)生[28]。過表達miR-338-3p明顯抑制OC活性,且使OC活性標志物表達顯著下調[29]。本研究用RT-qPCR檢測miR-338-3p在PMOP組骨組織中的表達水平升高，說明其可通過減弱成骨、增強破骨促進PMOP，符合miR-338-3p通過影響OB和OC的靶點調控絕經后骨質疏松成骨、破骨分化。

綜上所述，本研究miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在PMOP組骨組織中表達水平變化明顯，其可通過Wnt等靶點、相關因子調節(jié)成骨、破骨，影響PMOP。以上miRNA作為疾病的生物標志物不僅具有診斷價值，而且其本身或相關因子也可能成為新藥開發(fā)的作用靶點，本研究可為PMOP患者診治及研究提供相關依據(jù)。