基于網絡藥理學分析絞股藍治療骨質疏松癥的機制研究

甄瑞峰 盧文君 劉樹嬌

桂林醫學院附屬醫院全科醫療科，廣西桂林 541001

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種骨量低、骨組織微結構損壞，骨脆性增加，易發生骨折的全身性骨病。有調查報告顯示，我國OP 的患病率在50 歲以上人群為19.2%，其中男性為6.0%，女性為32.1%；65歲以上人群達到了32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%。OP 發病形勢嚴峻，給社會、家庭帶來了沉重的負擔。

近年來，有眾多學者研究傳統醫藥治療OP 的療效，進一步證明了中醫在OP 治療過程中的積極作用。絞股藍[Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino.]別名七葉膽、百味蓮，屬于葫蘆科、絞股藍屬草質攀援植物，以根狀莖入藥，有消炎退腫、活血祛風、降壓等功效。在中國、日本、朝鮮、東南亞等多地均有分布。絞股藍中含有類黃酮、皂苷、無機元素等，其提取物在治療動脈粥樣硬化、抑制腫瘤生長、抗抑郁方面有一定的療效。而近年的多項動物實驗證實，絞股藍的提取物在促進成骨細胞增殖、分化方面有一定的作用。本研究運用網絡藥理學的研究方法，探討絞股藍治療OP 的潛在有效成分及相關機制，為OP 的治療提供理論依據。

1 方法

1.1 獲取及篩選有效活性成分及其靶點

以“絞股藍”為關鍵詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems phar macology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進行檢索，獲得其化學成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性指數（drug like index，DL）≥0.18 為標準設定篩選條件。

使用Perl 軟件，對TCMSP 獲取的絞股藍所有成分所對應的靶點進行篩選，獲得絞股藍有效活性成分所對應的作用靶點。將有效活性成分對應的作用靶點利用UniProt（https//www.uniprot.org/）進行標準化處理，限定物種設定為“human（人）”，得到絞股藍有效活性成分的潛在靶點，將重復靶點和非標準靶點剔除，獲取有效活性成分所匹配的靶點庫。使用網絡可視化軟件Cytoscape3.8.2 構建有效活性成分-靶點網絡。

1.2 OP 作用靶點獲取

將“Osteoporosis”作為關鍵詞輸入Genecards（https://www.genecards.org/）、 藥物靶標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，db.idrblab.net/ttd）, 在線孟德爾人類遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/） 和藥物遺傳學與藥物基因組學知識庫（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB，https://www.pharmgkb.org）等數據庫中進行檢索，獲取OP 相關作用靶點。使用R 4.1.1 軟件合并4 個數據庫交集靶點。

1.3 絞股藍有效活性成分作用靶點與疾病靶點交集的獲取及構建網絡關系圖

使用R 4.1.1 軟件將絞股藍有效活性成分作用靶點和OP 作用靶點進行匹配，取交集靶點，并制作維恩圖。使用Cytoscape 3.8.2 軟件，構建絞股藍有效活性成分與交集靶點的網絡。

在該網絡中，節點代表絞股藍有效活性成分及其作用于疾病的靶點。邊代表活性成分-靶點的相互作用。節點的度值越大，越表示該節點在網絡中的作用越關鍵。

1.4 共同靶點的獲取和蛋白相互作用網絡的構建

使用R 4.1.1 軟件，對絞股藍有效活性成分作用靶點和OP 相關靶點進行匹配，篩選出共同靶點，作為治療OP 的潛在靶點，并制作維恩圖。將得到的共同靶點輸入STRING 11.5 版本（https://www.string-db.org），物種選擇人類（homo sapiens），選取置信度高于0.9 的數據，獲得蛋白相互作用（protein－protein interaction，PPI）關系，并構建網絡關系圖。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

將Bioconductor 軟件包安裝在R 4.1.1 軟件中運行，將絞股藍治療OP 的靶點以官方名稱“Gene Symbol”的格式輸入，進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。將閾值設定為P＜0.05。篩選有顯著性差異的生物學過程和通路。對GO 排名前十位的生物過程（biological process，BP）條目、細胞組成（cellular component，CC）條目、分子功能（molecular function，MF）條目及KEGG 排名前30 位的條目進行可視化。

2 結果

2.1 獲取及篩選有效活性成分及其靶點

以“絞股藍”為關鍵詞在TCMSP 數據庫中進行檢索，共獲得202 種成分，再按OB≥30%和DL≥0.18的條件對這202 種成分進一步篩選，獲得24 種有效活性成分（表1）。

表1 絞股藍有效活性成分基本信息

通過TCSMP 共獲取絞股藍作用靶點623 個，使用perl 軟件，對絞股藍的24 種有效活性成分所對應的靶點進行過濾，最終得到217 個對應靶點。運用UniProt 對獲取的靶點標準化，剔除重復和非標準靶點。利用Cytoscape 3.8.2 軟件完成絞股藍的有效活性成分及預測靶點的關系網絡圖。結果顯示，主要有效活性成分及作用靶點共存在169 個節點和192 條邊。其中，主要有效成分MOL000098 所對應的靶點最多，共有138 個，其次為MOL000351，有19 個作用靶點，推測以上活性成分可能發揮了關鍵作用（圖1）。

圖1 絞股藍有效活性成分-靶點網絡關系圖

2.2 獲取OP 作用靶點

以“Osteoporosis”作為關鍵詞輸入輸入GeneCards、OMIM、PharmGKB 和TTD 數據庫進行搜索，最終獲得疾病靶點4620 個。

2.3 獲取絞股藍有效活性成分作用靶點與疾病靶點的交集及構建網絡關系圖

將篩選出來的OP 作用靶點與獲取的絞股藍主要有效活性成分作用靶點取交集，獲得121 個交集靶點（圖2）。使用Cytoscape 3.8.2 軟件，構建絞股藍主要有效活性成分與交集靶點的網絡，結果顯示，共存在136 個節點和153 條邊，其中包括有效活性成分節點15 個，靶點節點121 個（圖3，封三）。

圖2 絞股藍主要有效活性成分作用靶點與OP 靶點的交集維恩圖

圖3 絞股藍的主要有效活性成分與交集靶點網絡關系圖

2.4 PPI 網絡的構建

向STRING11.5 數據庫中導入121 個交集靶點，選擇人類（homo sapiens），置信度設置為0.9，獲得蛋白相互作用關系，繪制PPI 網絡關系圖。結果顯示，共有節點121 個（其中有11 個游離節點），有420 條邊，平均節點度值為6.94，平均聚集系數為0.417，P＜1.0×10。節點度值越大，越可能在有效活性成分靶點和疾病靶點的相互作用關系中起到重要的作用。度值排名前十位的靶點分別為JUN 原癌基因（JUN proto-oncogene，JUN）、腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）、蛋白激酶（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、RELA 原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、Fos 原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）、Mys 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）、轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）（表2，圖4，封三）。

表2 絞股藍治療OP 的關鍵靶點（節點度值排序前10 位）

圖4 絞股藍與OP 的蛋白質互作網絡圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

應用統計軟件R 語言對靶點進行GO 富集分析，得到GO 條目2167 個，包括生物過程BP 條目1964個，CC 條目43 個，MF 條目160 個。BP、CC、MF 前10 條富集信息（圖5）。KEGG 通路富集分析篩選后得到信號通路162 條，根據基因頻率和qvalue 值排序，前30 的通路（表3、圖6）。

表3 KEGG 通路富集分析表

圖5 GO 功能富集分析圖

圖6 KEGG 通路富集氣泡圖

3 討論

中藥具有多成分、多途徑、多靶點的復雜作用特征，這種復雜特征使得很多中藥藥效基礎不明確，而且作用機制也不清楚。網絡藥理學是基于系統生物學的理論，利用“藥物-疾病-靶點-基因”的生物信息網絡關系，綜合分析多種大數據來進行藥理作用機制研究的模式。本研究通過網絡藥理學方法，利用相關軟件及網絡平臺，篩選出絞股藍的主要活性成分及其作用靶點、OP 的靶點、 絞股藍治療OP 的相關通路，來探討絞股藍治療OP 的機制。

本研究篩選出絞股藍治療OP 的主要有效活性成分有Sitosterol、Campesterol、CLR、Spinasterol、3'-methyleriodictyol、Ruvoside、Quercetin 等15 種。其中，Quercetin 的作用靶點最多。Quercetin 是一種多羥基黃酮醇類化合物，廣泛分布于多種植物中，如蘋果、漿果、洋蔥、西紅柿、連翹、銀杏葉，以及絞股藍中。具有抗氧化、抗炎、心臟保護等多種生物學活性。有研究表明，Quercetin 可以通過細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路來促進骨分化。也有研究顯示，Quercetin 能夠清除衰老的骨髓間充質干細胞，并通過雌激素受體介導的通路，促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨向分化，從而改善骨組織結構及功能。而關于Rhamnazin 的醫學相關研究，未見更多的報道。關于其與OP 的相互作用，有待進行下一步的研究。

絞股藍與OP 的蛋白質相互作用網絡圖顯示，JUN、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、ESR1、MAPK14、FOS、MYC、STAT1 等靶點度值相對較高。有研究顯示，AKT1 既促進骨細胞骨形成，也促進骨細胞骨吸收。AKT1 基因缺乏后成骨細胞的骨形成功能受損，可導致骨量減少。Mukkherjee 等也認為AKT1 能夠抑制成骨細胞分化，并加速骨吸收。JUN 屬于AP-1 轉錄因子家族，是JAK-STAT 信號通路上的基因，具有促進成骨細胞增殖、分化的作用。JUN 通過上調骨祖細胞相關基因的表達，誘導骨細胞增殖、分化，可以補償骨缺損部位的骨量減少并促進其骨鈣化組織形成，加速骨折愈合。TP53 基因編碼的p53 蛋白可以調控細胞分裂和增殖。有學者認為，TP53 誘導的核蛋白2可能通過激活β-catenin 信號通路及自噬調控對人脂肪干細胞起到成骨分化的作用。

GO 功能富集分析結果表明，絞股藍治療OP 的分子功能主要體現在細胞對化學或氧化應激的反應、對藥物的反應、活性氧反應、活性氧代謝過程、對脂多糖的反應、對細菌源性的分子反應等方面。成骨細胞前體細胞向成骨細胞分化可以被氧化應激抑制，從而抑制成骨細胞的礦化作用。但是這種機制尚不完全清楚。Byun 等根據研究推測，HO和腫瘤壞死因子α 通過激活c-Jun 氨基端激酶和核因子κB，從而導致人骨髓基質細胞（human bone marrow stromal cells，hBMSC）的凋亡。Park 等的研究提示氧化應激能夠激活ERK 信號轉導途徑來影響成骨細胞的基因表達，從而介導氧化應激誘導的成骨細胞死亡。脂多糖可通過刺激免疫細胞和局部臨近組織細胞增加炎癥因子的表達，進而誘導宿主發生一系列免疫反應。而炎癥因子可以通過多種途徑來影響成骨細胞與破骨細胞的活性和功能，進而在OP 的發生發展中起著重要作用。

在絞股藍治療OP 的主要靶點進行KEGG 富集分析，按P＜0.05，最終得到162 條信號通路，推測絞股藍通過多條信號通路在治療OP 方面發揮作用。排名靠前的有脂質和動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥AGRRAGE 信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎、前列腺癌、EB病毒感染等信號通路。

KEGG 富集分析顯示，血脂和動脈粥樣硬化通路注釋基因數相對較多。近年來研究發現，高脂血癥是OP 與動脈粥樣硬化的共同病因。在骨組織中脂質可能通過氧化作用來抑制成骨細胞活性，阻礙正常骨生成。脂質持續聚集在骨組織間隙脂質的持續聚集，會發生糖基化修飾及氧化，誘發炎癥反應和氧化應激，從而導致OP 形成。這個過程可能與Wnt/βcatenin 信號通路、Wnt/JNK 途徑或Wnt/Ca途徑的激活有關。

本研究基于網絡藥理學層面對絞股藍治療OP的作用機制進行了初步預測，其可能通過多靶點、多途徑來實現其藥效作用。但是，此次研究僅進行了數據分析來推測其作用機制，因此，下一步仍需要通過體內外實驗來進一步驗證。