低溫乳制品中沙門氏菌實時熒光PCR檢測方法體系的建立

陶文靖，趙婷婷，王 琦，董 彬，王玉花，王維嘉，劉赫東，曲連海*

（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.光明乳業股份有限公司華東中心工廠，上海 201111；3.通標標準技術服務（青島）有限公司，山東青島 266071；4.天津光明夢得乳品有限公司，天津 300499；5.通標標準技術服務有限公司武漢分公司，湖北武漢 430056）

近年來，我國居民對營養健康的關注度越來越高，對牛奶可以提升免疫力的認可度較高[1]。液態乳制品中低溫鮮奶以“更新鮮、更營養”的特點受到消費者的青睞。《2020中國奶商指數報告》顯示，96.0%的中國消費者認為低溫鮮奶富含乳鐵蛋白和免疫球蛋白等活性因子，能有效提升機體免疫力[2]。

近幾年，國產優質低溫巴氏殺菌乳的滅菌溫度已由105 ℃降低到75 ℃，乳中含有的乳鐵蛋白、免疫球蛋白、過氧化物酶等對人體有益的活性成分得到最大限度的保留，可以達到進口乳制品的8倍[3-4]。這種殺菌工藝殺滅了大部分微生物，允許殘留部分微生物，將微生物含量降低到不會威脅人體健康的程度[5]。低溫乳制品保質期短，根據包裝形式的不同，在2～6 ℃條件下，巴氏殺菌乳保質期一般為2～7 d，低溫酸奶保質期一般為14～21 d[6]。巴氏殺菌乳對運輸、儲存條件要求較高，一旦儲存溫度達不到要求，可能會存在微生物增殖的風險[7]。食源性致病菌是引起食品安全問題的主要因素之一，而微生物污染是導致牛奶質量問題的重要因素，因此牛奶中的致病菌成為消費者關注的焦點[8-10]。根據我國國標要求，需重點關注的致病性微生物有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等。

沙門氏菌（Salmonella）屬于腸桿菌科革蘭氏陰性需氧及兼性厭氧菌，沙門氏菌感染是引起人類食源性腸胃炎的重要病因之一[11]。沙門氏菌感染最常見于動物源食物，通過攝入動物源性受污染的食品造成的食物中毒占人類沙門氏菌病例的75%[12]。《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）規定，我國乳及乳制品中沙門氏菌的限量是n=5，c=0，m=0 CFU/25 g（mL）；國際食品法典委員 會（Codex Alimentarius Commission，CAC）對 于乳制品中沙門氏菌的限量是n=15，c=0，m=0 CFU/25 g（mL），對于用于特殊食療目的乳制品的采樣方案相對嚴格，n=30，c=0，m=0 CFU/25 g（mL）[13]；澳大利亞、新西蘭、美國、韓國和英國等眾多國家對沙門氏菌的限量要求也是25 g（mL）不得檢出，取樣量n略有差別[14]。

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）中沙門氏菌檢驗流程通常為3～7 d，此標準在食品安全領域為保障人們的身體健康作出突出貢獻，但操作較煩瑣，耗時長，不能滿足快速檢測需求[15]。低溫乳制品保質期較短，終成品快速放行以及流通過程中的快速監控尤為重要。2021年8月《乳制品生產許可審查細則（征求意見稿）》公開征求意見中，要求企業針對短保產品建立有效的微生物快速檢測方法。

國內現行有效的沙門氏菌實時熒光聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）行業標準方法，操作環節復雜，對人員操作要求較高，需要2步增菌，時間較長[16]。本研究是要建立一套更嚴格、簡單、適合企業操作的沙門氏菌實時熒光PCR方法，以滿足低溫乳制品生產加工過程及終產品快速放行、及時糾偏的需求，提高致病菌檢測技術能力，降低食品安全風險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ATCC 14028鼠傷寒沙門氏菌、CICC 21498鴨沙門氏菌、CMCC（B）50071傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50093甲型副傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50094乙型副傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50335腸炎沙門氏菌，標準菌株；高溫殺菌乳（低溫保藏）；巴氏殺菌乳；發酵乳；腦心浸液培養基(Brian Heart Infusion，BHI)；緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）培養基；MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養基。

1.2 儀器與設備

PCR儀（型號為SLAN-96P，上海宏石醫療科技有限公司）；勻質器（型號為BagMixer@400，Interscience）；渦旋振蕩器（型號為MX-S，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司）；恒溫培養箱（型號為BPC-150F，LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司）；恒溫搖床（型號為ZWY-240，上海智誠分析儀器制造有限公司）；離心機（型號為5430R，Eppendorf）；金屬浴（型號為OSE-DB-01，天根生化科技有限公司）。

1.3 方法體系的選擇

結合準確性、可操作性、方法趨勢、整體檢測時間以及成本等，最終選定的方法體系為快速增菌結合實時熒光PCR，增菌液直接進行初篩，陽性結果進一步采用國標方法進行確認。進而對方法體系進行可行性研究、優化以及方法評價，最后形成方法體系。

1.4 方法可行性研究

1.4.1 實時熒光PCR試劑盒靈敏度評價

取沙門氏菌培養物，用無菌水進行10倍系列梯度稀釋，同時檢測沙門氏菌的濃度。以不同濃度的稀釋液為樣本，用檢測體系中的裂解液裂解后，使用PCR試劑盒進行檢測，每個濃度梯度重復10次。記錄不同沙門氏菌不同濃度的陽性檢出率。

1.4.2 培養基的增菌效果評價

取 25 g（mL）樣品于 225 mL MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養基中，按照（5～10） CFU/25 g的濃度進行沙門氏菌標準菌株的添加，勻質2 min，（36±1）℃培養24 h。計數增菌后18 h和24 h的沙門氏菌濃度。

1.5 方法體系的評價

在方法系統針對目標菌沙門氏菌檢測的特異性方面，使用20株目標菌和15株非目標菌驗證其包容性和排他性；在方法體系針對低溫乳制品的適用性方面，通過采用人工添加菌種到不同類型樣品的方式，驗證方法體系在靈敏度、方法準確度等方面與參考標準方法的一致性。

1.5.1 特異性驗證

取沙門氏菌陽性菌株20株和非沙門氏菌15株，用無菌接種環將各菌株劃線接種于BHI瓊脂平板中，（37±1）℃培養18～24 h。用無菌接種環挑取單菌落，置于50 μL無菌PBS中混勻，制備成菌懸液，分別按照PCR方法體系進行檢測。

1.5.2 與參考標準方法一致性驗證

（1）菌懸液制備。將沙門氏菌標準菌株（鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、傷寒沙門氏菌 CMCC（B）50071）和非沙門氏菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922、福氏志賀氏菌 CMCC（B）51572、銅綠假單胞菌 ATCC 27853）用無菌接種環分別劃線接種于BHI瓊脂平板上，（37±1）℃培養18～24 h。用無菌接種環挑取單菌落，接種于BHI液體培養基，恒溫搖床（37±1）℃，160 r/min，振搖培養18 h。用平板計數瓊脂培養基計數菌液濃度，并用無菌PBS培養基制備10倍梯度稀釋液。

（2）人工添加樣品制備。取高溫殺菌乳（低溫保藏）、巴氏殺菌乳、發酵乳各60個，每個樣品稱取2份各25 g，其中一份按照方法體系加入225 mL沙門氏菌增菌培養基，另一份加入GB 4789.4—2016中的稀釋液緩沖蛋白胨水（BPW），發酵乳樣品使用無菌1 mol/L NaOH調節pH值至7.0±0.5。分別同時添加目標菌和非目標菌，制備成陰性控制樣品54個（目標菌濃度為0 CFU/25 g，非目標菌濃度為50～100 CFU/g）、低濃度污染樣品63個（目標菌濃度為5～10 CFU/25 g，非目標菌濃度為50～100 CFU/g）和高濃度污染樣品63個（目標菌濃度為50～100 CFU/25 g，非目標菌濃度為500～1 000 CFU/g）。

（3）樣品測試。加入沙門氏菌增菌培養基的樣品按照方法體系進行測試，加入BPW增菌液的樣品，按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）進行培養和鑒定。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR試劑盒的靈敏度驗證

用試劑盒檢測不同沙門氏菌菌株的不同濃度，如圖1所示，當菌濃度＞104CFU/mL時，陽性檢出率為100%。（圖1中ATCC 14028與CICC 21498曲線重合，CMCC（B）50093與CMCC（B）50335曲線重合，所有編號菌株曲線末端重合）。

圖1 不同濃度沙門氏菌的陽性檢出率

2.2 培養基的增菌效果驗證

使用MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養基，以無菌水和發酵乳為基質，進行不同沙門氏菌的低濃度加標（100CFU），經過（36±1）℃培養18～24 h后，沙門氏菌的菌株終濃度＞107CFU/mL，以沙門氏菌最低檢出限1 CFU/25 g來計算，最終增菌濃度＞106CFU/mL，見圖2。

圖2 快速增菌培養基增菌效果

2.3 方法體系的確定

經過可行性研究確定，由快速增菌培養基結合實時熒光PCR組成的體系是可行的，建立的方法體系如圖3所示。

圖3 方法體系流程圖

2.4 方法體系特異性驗證

取沙門氏菌陽性菌株20株和非沙門氏菌15株，制備菌懸液后，取40 μL菌懸液制備DNA模板后，使用PCR方法體系檢測。結果表明，20株沙門氏菌陽性菌株的檢測Ct值均小于35，結果均判定為“沙門氏菌陽性”；而對15株非沙門氏菌菌株均沒有出現特異性擴增，檢測Ct值均大于40或無值，結果均判定為“沙門氏菌陰性”，具體結果見表1。

表1 PCR方法體系特異性檢測結果

2.5 與參考標準方法一致性驗證

對高溫殺菌乳（低溫保藏）、巴氏殺菌乳、發酵乳各60個人工污染的樣品，每個樣品稱取2份各25 g，分別用方法體系和GB 4789.4—2016進行檢測，檢測結果匯總見表2。

表2 兩種檢測方法對人工污染樣品的檢測結果

檢測結果表明，54份陰性控制樣品用兩個方法檢測，檢測結果均為陰性，126份添加了陽性目標菌的樣品，PCR方法體系全部檢測陽性，而國標方法為122份樣品檢出陽性，4份樣品為陰性。4份未檢出的樣品全部為低染菌濃度的發酵乳樣品。對兩個方法的檢測結果，采用卡方檢驗比較差異性，表明PCR方法體系與參考方法GB 4789.4—2016的陽性確證率在5%置信區間內無統計學差異（χ2=2.25＜3.84）。根據ISO 16140-2：2016計算PCR方法體系的靈敏度為100%，國標方法的靈敏度為96.8%，相對正確度為97.8%。

3 結論與討論

通過對方法體系的系統化驗證，該方法可以實現沙門氏菌24 h內的增菌和檢測。其中高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳參比方法與驗證方法檢測結果與加標結果一致，發酵乳樣品驗證方法靈敏度稍高于參比方法。發酵乳樣品的pH一般在4.5左右，而沙門氏菌最適生長pH為6.6～8.2，酸性環境會抑制沙門氏菌生長[17]。因此，在檢測發酵乳樣品的時候需要調整pH至中性。大部分發酵乳樣品中會添加濃度超過1×106CFU/mL的活性益生菌成分，這些益生菌在增菌過程中會大量生長，對沙門氏菌生長造成抑制[18-19]。本方法體系中采用的培養基中含有部分pH緩沖成分，能夠緩沖樣本帶來的pH值變化。同時，體系中含有部分中和劑，能減弱乳酸菌素等對腸道致病菌的抑制作用。

方法體系的建立考慮了實際操作者的需求，一個方法體系的準確性是由方法學的準確性和操作可實施性共同決定的。因此，本實驗選擇的PCR試劑盒在生產的過程中就進行預分裝，減少實驗室操作，并降低污染風險，同時優化了核酸提取的操作，直接將增菌液加入裂解液中進行熱裂解，降低操作造成的誤差，前處理時間由3～4 h縮短為40 min。在確保準確性的情況下，更方便企業用戶的實際應用。有關部門在修訂制相關標準時可以綜合考慮方法的可實施性因素。