液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中那可丁的不確定度評定

白德奎，許娟娟，劉青洋，文 才，趙何蓮

（綿陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川綿陽 621000）

那可丁是一種有機化合物，最早是從罌粟屬植物鴉片中提取得到，主要作為鎮(zhèn)咳藥使用，食品中的那可丁來源于常見的肉制品、醬料以及調(diào)味料等[1]。因罌粟殼中含有的多種生物堿能引起某種程度的愜意和快感，長期攝入會產(chǎn)生嚴重的依賴性且危害人體健康。因此，《中華人民共和國食品安全法》明令禁止在食品中添加。目前，那可丁的測定通常采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS-MS），本文參照標(biāo)準《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》（BJS 201802）[2]和測定不確定度評定與表示相關(guān)標(biāo)準[3-4]，對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定那可丁含量的測量不確定度進行評定，確定影響檢測結(jié)果的不確定度的主要影響因子，為今后的質(zhì)檢工作提供工作關(guān)鍵控制點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；離心機；粉碎機；超聲波清洗器；渦旋混合器；分析天平；勻漿機。

甲醇（優(yōu)級純）；乙腈（優(yōu)級純）；甲酸（優(yōu)級純）；鹽酸；甲酸銨（優(yōu)級純）；無水醋酸鈉；無水硫酸鎂。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2.00 g樣品置于50 mL具塞離心管（聚四氟乙烯）中，液體（半固體）樣品加入1.00～3.00 mL水，固體樣品加入5.00 mL鹽酸溶液。渦旋振蕩30 s，準確加入15.00 mL乙腈，密塞，渦旋振蕩1 min，超聲處理30 min，加入6.00 g無水硫酸鎂和1.50 g無水醋酸鈉的混合粉末，立即渦旋振蕩2 min后以4 000 r/min離心5 min，取上清液，以0.22 μm濾膜過濾，樣品待測。

1.2.2 標(biāo)準工作溶液的配制

分別移取1 μg/mL那可丁標(biāo)準溶液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL和1.00 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液定容，即得系列標(biāo)準工作溶液。

1.2.3 測定方法

采用《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》（BJS 201802）中規(guī)定的方法測定那可丁含量。

1.2.4 不確定度數(shù)學(xué)模型

以標(biāo)準工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以那可丁峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。利用校準曲線回歸方程計算樣品中的那可丁含量。那可丁定量檢測的數(shù)學(xué)模型如下：

式中：X為樣品中那可丁的含量，μg/kg；C為由標(biāo)準曲線計算出試樣定容溶液中那可丁的濃度，ng/mL；V為樣品的最后定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 不確定度評定

根據(jù)檢測流程及數(shù)學(xué)模型，該方法測定的不確定度因素主要包括樣品前處理過程、標(biāo)準溶液配制、標(biāo)準曲線擬合、樣品檢測以及回收率。

2.1 樣品前處理過程引入的測量不確定度urel(C1)

2.1.1 分析天平稱量引入的測量不確定度urel(m)

（1）分析天平示值誤差引入的測量不確定度urel(m1)。校準證書給出分析天平的允許誤差限為0.05 g，用均勻分布計算，包含因子為。每個樣品稱量過程相互獨立，共計4次，分析天平示值誤差引入的標(biāo)準不確定度為稱量樣品2.00 g，分析天平示值誤差引入的相對標(biāo)準不確定度為

（2）分析天平的偏載誤差引入的測量不確定度urel(m2)。校準證書給出天平偏載允許誤差限為0.1 g，每個樣品稱量過程相互獨立，使用電子天平稱量4次，標(biāo)準不確定度為分析天平的偏載誤差引入的相對標(biāo)準不確定度為

（3）分析天平重復(fù)稱量引入的測量不確定度urel(m3)。校準證書給出天平偏載允許誤差限為0.15 g，每個樣品稱量過程相互獨立，使用電子天平稱量4次，標(biāo)準不確定度為分析天平重復(fù)稱量引入的相對標(biāo)準不確定度為

因此，分析天平稱量引入的相對標(biāo)準不確定度為：

2.1.2 樣品前處理過程移液管引入的測量不確定度urel(P)

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[5]樣品前處理過程移液管引入的不確定度分量見表1。樣品前處理過程移液管引入的相對標(biāo)準不確定度為0.007 25。

表1 樣品處理過程移液管引入的相對標(biāo)準不確定度

2.1.3 空白樣品測量引入的測量不確定度urel(B)

空白樣品測量只涉及移液管的使用，故引入的測量不確定度等同于移液管引入的相對標(biāo)準不確定度，即urel(B)=0.007 25。

綜上可知，樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準不確定度為：

2.2 標(biāo)準溶液配制引入的不確定度urel(C2)

（1）標(biāo)準使用液引入的測量不確定度urel(S)。檢測用那可丁標(biāo)準物質(zhì)（1ST45021），質(zhì)量濃度為10 μg/mL，相對擴展不確定度為Ur=5%（k=2）。則標(biāo)準使用液引入的相對標(biāo)準不確定度為

（2）容量瓶引入的測量不確定度urel(V)。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）中表6的要求，容量為10 mL的A級單標(biāo)線容量瓶的最大示值允許誤差為0.020 mL，共使用5次。標(biāo)準不確定度為容量瓶引入的相對標(biāo)準不確定度為

（3）移液槍引入的測量不確定度urel(G)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[6]的要求，使用移液槍配制標(biāo)準曲線產(chǎn)生的不確定度分量見表2。移液槍引入的相對標(biāo)準不確定度為0.020 8。

表2 樣品處理過程移液槍產(chǎn)生的不確定度

因此，標(biāo)準溶液配制引入的相對標(biāo)準不確定度為：

2.3 標(biāo)準曲線的測量不確定度urel(C3)

標(biāo)準曲線擬合方程為y=6.613×104x+9.598×104；r=0.999 0）。由表3可知，標(biāo)準曲線中，x-=38.00，y-=2 608 776.8。觀測值和理論值的對應(yīng)關(guān)系見表4。

表3 標(biāo)準曲線測定結(jié)果表

表4 觀測值與理論值對應(yīng)關(guān)系表

標(biāo)準曲線殘余殘差公式為：

樣品含量標(biāo)準偏差公式為：

式中：n為濃度點個數(shù)；由于回歸偏差平方和的自由度只與斜率a有關(guān)，其自由度為n-2。p為被測物測量平行次數(shù)；x-s為被測物測量平均值，ng/mL。

試驗中測定兩次得到被測物的信號強度分別為2 002 407、2 013 631，代入校準曲線均值為x-s=28.91 ng/mL。由公式（2）得到標(biāo)準曲線殘余殘差S=124 142.93，由公式（3）得到被測物含量標(biāo)準偏差S(x0)=1.58。則校準曲線引入的相對標(biāo)準不確定度為

2.4 回收率引入的測量不確定度urel(C4)

回收率的分量包含儀器響應(yīng)和重復(fù)性。儀器響應(yīng)包含在重復(fù)性中，故可直接利用回收率的重復(fù)性標(biāo)準偏差表示回收率的測量不確定度。實驗中共檢測回收率3次，得到的平均回收率x-=104.8%，標(biāo)準偏差S=4.10。相對標(biāo)準不確定度為urel(C4)=0.039 1。

2.5 樣品檢測引入的測量不確定度urel(C5)

樣品檢測的測量不確定度分為儀器響應(yīng)和檢測的重復(fù)性。儀器響應(yīng)包含在重復(fù)性中，只需評定檢測的重復(fù)性即可，結(jié)果見表5。樣品檢測引入的相對標(biāo)準不確定度為0.015 6。

表5 樣品檢測的測量不確定度

2.6 擴展不確定度

通過計算可得，那可丁的合成標(biāo)準不確定度為：

取包含因子k=2，方法的相對擴展不確定度為U=kurel(C)=0.260 4，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中那可丁的含量為221.5 μg/kg，擴展不確定度為U=0.260 4×221.5=57.7 μg/kg。因此，食品中的那可丁測定結(jié)果為（221.5±57.7）μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本實驗中試樣中的那可丁含量表示為（221.5±57.7）μg/kg，k=2。通過對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定那可丁含量的測量不確定評定來源進行分析和評定發(fā)現(xiàn)，在測定過程中樣品前處理、標(biāo)準溶液配制和標(biāo)準曲線擬合對樣品檢測的不確定度影響較大，而其余不確定度分量影響不大。