用于抗結核藥物異煙肼檢測的碳點/二氧化錳納米探針的構建

王新旭，樊柄君，閆曉輝，王 寧

（1.山西醫科大學 第一臨床醫學院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學 法醫學院，山西 太原 030001；3.山西醫科大學 基礎醫學院，山西 太原 030001）

肺結核是一種嚴重威脅人類健康的呼吸道傳染病，每年全球范圍內有數百萬人口罹患結核病［1］。異煙肼（Isoniazid，INH）作為主要的抗結核藥物之一，在現階段肺結核的治療中通常與其他藥物聯合使用。臨床上，每個成年人每天服用INH 的最佳劑量約為4 ～6 mg/kg，不合理使用不僅會增加耐藥性風險，還會導致肝毒性［1］、神經系統毒性［2］、過敏性皮疹［3］等副作用，甚至死亡。INH 含量的測定在藥品質量控制或用藥安全方面具有重要意義。

目前為止，已報道了各種測定INH的分析方法，包括滴定法［4］、紫外分光光度法［5］、流動注射化學發光法［6-7］、毛細管電泳［8］、電化學技術［9-10］、高效液相色譜（HPLC）［11-12］等。這些方法各有優勢，但也有局限性，如傳統的分光光度法、化學發光法和毛細管電泳法靈敏度不高；高效液相色譜法通常需要先進和復雜的儀器、大量的有機試劑和復雜的操作；電化學電極表面易受污染，影響測定的重復性和靈敏度。與上述方法相比，熒光光譜法具有選擇性強、成本較低、操作簡單、靈敏度高的優勢，在檢測領域引起了廣泛關注，現已用于INH的定量檢測。Zahra等［13］合成了殼聚糖納米碳點作為熒光探針檢測INH；Qin等［14］將葉酸熱解合成碳點，以熒光法實現了生物樣本中INH的檢測。這些熒光探針檢測異煙肼的檢出限為μmol水平。為進一步降低檢出限，提高靈敏度，構建一種能夠簡單、快速、靈敏檢測INH的納米熒光探針顯得非常重要。

CDs是一種尺寸小于10 nm的新型碳納米材料，具有較高的熒光量子產率、較強的抗光漂白性能和良好的生物相容性，近年來已成為生物成像［15］、生化分析［16］、微量分析［17］等領域的研究熱點，在熒光檢測領域也受到了廣泛的關注［18］。MnO2納米材料具有比表面積大、制備方便、紫外和可見光區吸收能力強等優點，優異的光吸收性能賦予其作為猝滅劑構建納米熒光探針的潛能，在分析領域引起了極大關注［19-21］。基于MnO2納米片對CDs熒光的良好猝滅效果，許多研究人員將這兩種納米材料結合用于檢測，并在分子［22］、離子［23］和藥物［24-25］分析領域展現出卓越的應用價值和廣闊的發展前景。

本文使用微波法快速合成了CDs，通過在該CDs 溶液中加入MnO2納米片構建了一種檢測INH 的納米熒光探針。采用透射電子顯微鏡（TEM）、X 射線光電子能譜（XPS）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、X 射線衍射（XRD）、紫外可見吸收光譜（UV-Vis）和熒光光譜對材料的形貌和結構進行表征。MnO2納米片可通過熒光共振能量轉移（FRET）猝滅CDs 的熒光；但加入INH 之后，INH 與MnO2發生氧化還原，碳點的熒光得以恢復，據此可對INH 進行測定。該納米探針不僅成本低、易于制備、綠色環保，且對INH具有高選擇性和高靈敏度的優勢，在生物樣品INH的檢測中具有廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

4500型熒光分光光度計、U3900紫外可見分光光度計（日本日立公司）；JEM-1011透射電子顯微鏡（日本電子光學公司）；Paragon 1000型紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；微波爐（700 W，中國格蘭仕微波生活電器有限公司）；FA1004N 電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；PHSJ3F 型實驗室pH 計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）；791 磁力加熱攪拌器（北京科偉永興儀器有限公司）；透析袋購自上海橋星貿易有限公司。

無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；磷酸（85%）、磷酸鈉（分析純）（南京化學試劑有限公司）；乙腈（天津市博迪化工股份有限公司）；異煙肼（INH）、檸檬酸、硫脲、奎寧、四甲基氫氧化銨（TMA·OH）、四水合氯化錳（MnCl2·4H2O）、N-乙基順丁烯二酰亞胺（NEM）、葡萄糖、尿素、尿酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸、草酸、NaOH、H2O2、KNO3、CaCl2、NaCl均購自阿拉丁工業公司（中國上海）。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 CDs及MnO2納米片的制備

CDs 的制備［26］：將檸檬酸（1 g）和硫脲（1 g）溶于去離子水（DI，20 mL）中，將該溶液在700 W 微波爐中加熱5 min，得到深色的粘性固體。將固體產物加水溶解，離心10 min（8 000 r/min）去除沉淀。棕色上清液以15 000 r/min 離心10 min，得到的上清液再用去離子水以透析膜（1 000 Da）透析12 h，冷凍干燥得到固體粉末。

MnO2納米片的制備［27］：將10 mL 四水合氯化錳（MnCl2·4H2O，0.3 mol/L）和20 mL 四甲基氫氧化銨（TMA·OH，0.6 mol/L，含3%（質量分數）的H2O2）混合，25 ℃攪拌反應12 h，10 000 r/min 離心15 min，收集沉淀。最后，將所得產物分別用超純水和甲醇各洗滌3次，收集沉淀，50 ℃下干燥1 h。

1.3 熒光檢測INH

將50 μL MnO2納米片溶液（9.5 mg/mL）加入500 μL CDs 溶液（0.1 mg/mL）中，用PBS 緩沖液（pH 7.4）定容至20 mL，形成CDs/MnO2溶液。取10 μL INH 溶液于熒光比色皿中，用配制好的CDs/MnO2溶液定容至2 mL。室溫下反應15 min 后，測定體系的熒光強度，在360 nm 激發波長下記錄熒光發射光譜（激發和發射狹縫均為10 nm）。

1.4 熒光量子產率的測定

以硫酸奎寧為參比樣品，分別記錄CDs溶液和硫酸奎寧（QYs＝0.54，ηs＝1.33）的紫外可見吸光度值和熒光發射光譜，用公式QY＝QYs×（Iu/Is）×（As/Au）×（ηu/ηs）2計算CDs 的熒光量子產率。式中，QY為熒光量子產率；I為積分強度，A為吸光度；η為溶液的折光率，下標u 和s 分別代表CDs 和硫酸奎寧。通過計算得到CDs的熒光量子產率為22.34%。

1.5 實際樣品的制備

尿樣和血樣的制備：人的尿樣和血樣由健康志愿者提供。首先將尿液以10 000 r/min 離心30 min，收集上清液，用超純水稀釋100 倍，置于4 ℃冰箱中備用。采血后立即取血漿，于3 000 r/min 離心5 min，保存于4 ℃冰箱。使用時向血漿中加入等體積乙腈，攪拌1 min 后，在4 000 r/min 下離心15 min，得到上清液，向上清液中加入NEM（150μmol/L）以阻斷巰基物質的干擾。

片劑樣品的制備：在研缽中將INH片劑充分研磨，將得到的粉末溶解于50 mL蒸餾水中，稀釋100倍，用0.22μm微孔濾膜過濾，得到澄清溶液。

2 結果與討論

2.1 CDs與MnO2納米片的結構表征

用透射電子顯微鏡（TEM）對CDs和MnO2納米片的形貌進行表征。如圖1A所示，CDs顆粒形狀接近球形，分散性良好，粒徑分布在2.0～3.0 nm。HRTEM 圖像（圖1A 插圖）顯示，CDs晶格間距為0.21 nm。圖1B顯示，MnO2納米片具有典型的二維片狀形貌。X射線衍射（XRD）圖譜（圖1C）顯示CDs在22.9°處有一個較寬衍射峰，表明CDs存在無序的碳結構；MnO2納米片在12.1°、24.5°、36.6°和65.6°處有特征峰，與文獻中α-MnO2納米片的特征峰一致，說明制備的為α晶型的MnO2納米片［28］。

此外，FT-IR光譜（圖1D）表明CDs表面存在多種官能團。3 431 cm-1處的峰代表N—H/O—H的伸縮振動，表明CDs含有大量的氨基和羥基，這些基團賦予CDs良好的親水性。3 600 ～3 100 cm-1處的寬吸收峰屬于O—H和N—H的伸縮振動，位于3 182、1 663、1 415 cm-1處的峰分別屬于C—H、C==C和C—N的伸縮振動，1 709 cm-1處的吸收峰代表—COOH中C==O的伸縮振動，2 060 cm-1處的吸收峰歸屬于C≡≡N的伸縮振動，2 366 cm-1和1 185 cm-1處的吸收峰分別代表S—H和C==S的伸縮振動。MnO2納米片的FTIR圖（圖1D）在3 405、1 643、521 cm-1處的峰分別歸屬于O—H、C—O和Mn—O的伸縮振動。

圖1 CDs（A）、MnO2納米片（B）的TEM圖譜及其XRD圖譜（C）和FT-IR圖（D）Fig.1 TEM images of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B），and their XRD（C）and FT-IR（D）patterns the inset A shows the HRTEM image of CDs

CDs的X射線光電子能譜（XPS）如圖2A所示，161.7、225.0、282.0、398.1、528.9 eV處出現的尖峰分別對應S2p、S2s、C1s、N1s和O1s，表明所得到的CDs主要由碳、氮、氧和硫元素組成。將CDs的XPS總譜分解得到C1s、N1s、O1s和S2p的精細圖譜。C1s在284.5、285.6、287.8、288.8 eV處的吸收分別代表C==C、C—N/C—O、C==N/C==O 和O—C==O 基團。N1s譜在399.1、399.8 eV 處有兩個峰，分別對應C—N—C 和N—C 鍵。O1s 的擬合譜圖在531.6、533.7 eV 處有兩個峰，分別歸屬于C==O 和C—OH/C—O—C鍵［28］。在S2p的擬合譜圖中有4個峰，分別對應亞砜（164.9 eV）、—C==S—（163.9 eV）、—C—Sn—C（163.0 eV，n＝1或2）和—SH（163.5 eV）鍵。

圖2 CDs（A）和MnO2納米片（B）的XPS全譜圖譜Fig.2 XPS spectra of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B）

MnO2納米片的XPS 如圖2B 所示，在282.0、397.1、527.9、640.1 eV 處的4 個峰，分別對應C1s、N1s、O1s和Mn2p。將MnO2的XPS總譜進一步分解得到Mn2p和Mn3s的精細譜圖。Mn2p在642.0 eV和653.9 eV 處有兩個峰，分別為Mn2p3/2和Mn2p1/2的特征峰。此外，Mn3s 光譜的ΔE約為4.97 eV，表明MnO2納米片主要以Mn（Ⅳ）價態存在［29］。這些結果表明MnO2納米片成功合成。通過紫外可見吸收光譜（圖3A 曲線a）進一步證實了MnO2納米片的光學特性，其在360 nm 處有1個峰，在250 ～600 nm 處有較寬的吸收帶；熒光圖譜（圖3A 曲線b、c）顯示，CDs 的激發和發射與MnO2納米片的吸收有很大的重疊區域。

圖3 CDs的熒光激發和發射光譜及MnO2納米片的紫外可見吸收光譜（A）與不同濃度的MnO2納米片對CDs熒光強度的影響（B）Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra of CDs，UV-Vis absorption spectra of MnO2 nanosheets（A），and effect of different concentrations of MnO2 nanosheets on the fluorescence intensity of CDs（B）

2.2 CDs的穩定性

研究了CDs在不同pH值的PBS溶液、不同濃度的氯化鈉溶液和紫外照射條件下于360 nm激發光下的熒光強度，發現CDs的熒光強度受環境影響較小，只在酸性較強的環境中熒光值降低，證明CDs具有良好的穩定性。

2.3 實驗條件的優化

為獲得INH 的最佳測定條件，分別對pH 值、反應時間和MnO2納米片的濃度進行了優化。考察了不同pH 值（4.0 ～11.0）對CDs/MnO2-INH 體系熒光強度的影響，以IF0為CDs 的熒光強度，IF1為加入MnO2納米片后的熒光強度，IF2為MnO2納米片和INH 共同存在時CDs的熒光強度。在pH 4.0 ～7.4范圍內，隨著pH 值的增加，IF0/IF1與IF1/IF2的值均不斷增大，并在pH 7.4 時達到最大值；隨著pH 值繼續增大，兩比值均逐漸減小，即PBS緩沖液的pH值為7.4時INH的檢測靈敏度最高。

在加入MnO2納米片后CDs 的熒光強度迅速降低，1 min 后趨于穩定。在CDs/MnO2納米片中加入20μmol/L的INH，熒光強度隨孵育時間的延長而增加，15 min后達到穩定，故15 min為最佳反應時間。

為研究MnO2納米片濃度對CDs 熒光的影響，將一系列濃度的MnO2納米片與CDs 混合，并加入20μmol/L 的INH。結果顯示CDs 的熒光強度隨著MnO2納米片濃度的增加而逐漸減弱，當MnO2納米片的濃度為2 mmol/L時，猝滅效率達到99%左右（圖3B）。而MnO2納米片濃度為0.2 mmol/L時，INH對于CDs 熒光的恢復最靈敏，其濃度大于2 mmol/L 時不利于CDs 熒光的恢復。綜合考慮，確定MnO2納米片的最佳濃度為0.2 mmol/L。

2.4 方法檢出限

加入INH 后，CDs/MnO2檢測體系的熒光明顯恢復。而無MnO2納米片存在時，即使INH 濃度增至100 mmol/L，CDs 的熒光也不發生變化，表明INH 對CDs 的熒光沒有影響。向CDs/MnO2檢測體系中加入INH，溶液顏色由棕色變為無色，這是由于MnO2納米片與INH 發生氧化還原反應分解為Mn2+，令MnO2溶液的棕色消失，CDs的熒光恢復。

考察了最佳條件下，不同濃度的INH對CDs/MnO2熒光光譜的影響。結果表明，CDs/MnO2納米探針的熒光恢復效率與INH的濃度在0.5 ～60μmol/L范圍內呈線性關系，其回歸方程為y＝0.062 6x+1.098 8，相關系數r2＝0.998，其中x表示異煙肼的濃度（μmol/L），y表示IF/IF0（IF0和IF分別為加入INH前后CDs/MnO2的熒光強度）。以3σ/K計算檢出限（LOD）（σ為空白樣本的標準方差，K為線性方程的斜率），得到LOD為0.02μmol/L。與大多數已報道的INH測定方法（表1）相比，本方法具有較低的檢出限。

表1 與其他檢測方法的對比Table 1 Comparison with other detection methods

2.5 CDs/MnO2對INH檢測的選擇性及抗干擾能力

考察了常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH 的影響，結果如圖4 所示。圖中IF0 與IF 分別代表加入INH 前后CDs/MnO2的熒光強度。從圖4A 可觀察到只有INH 能顯著恢復CDs/MnO2體系的熒光，其它常見糖類（Glu 和Fru）、生物大分子（Vc、Ace、UA、H2O2、Gly、His、Cys-NEM、GSH-NEM、OA、urea）和金屬離子（K+、Ca2+、Na+或Zn2+）不會使CDs/MnO2+INH 體系的熒光強度發生明顯恢復。探究了干擾物質存在下，INH 對CDs/MnO2體系的熒光恢復情況，結果如圖4B 所示，當INH 濃度為50μmol/L，控制相對誤差在±5%以內時，濃度為500μmol/L 的常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH無明顯干擾。上述實驗結果表明CDs/MnO2可特異性識別INH，常見糖類、生物大分子和金屬離子在0 ～500μmol/L范圍內對INH測定的干擾性較小。

圖4 CDs/MnO2對INH的選擇性檢測（A）及常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH的干擾性（B）Fig.4 Selective detection of INH by CDs/MnO2（A），interference of common carbohydrates，biomacromolecules and metal ions on the detection of INH by CDs/MnO2（B）

2.6 實際樣品測定

選取人尿樣和血清樣品作為研究對象，考察探針在實際樣品中檢測INH 的適用性和可靠性。向空白尿樣和血清樣品中加入INH 標準溶液，制成不同濃度（4、20、50μmol/L）的加標樣品，進行加標回收實驗，每個濃度重復測定3次，得到空白血樣和尿樣中INH 的回收率分別為94.8%～116%、99.0%～105%，相對標準偏差（RSD）均不超過5%（表2）。此外，將該方法用于市售片劑中INH 的檢測，得到的INH 濃度與片劑的標示量非常接近，加標回收率為96.8%～102%，RSD 小于5%（表3），滿足《中華人民共和國藥典》（2020年版）［35］對同一片劑中INH含量的要求。

表2 血樣和尿樣中INH的檢測Table 2 Detection of INH in blood and urine samples

（續表2）

表3 片劑中INH的檢測Table 3 Detection of INH in tablets

2.7 機理研究

CDs 的熒光可被MnO2納米片猝滅，由于CDs 的熒光發射光譜與MnO2納米片的紫外吸收光譜重疊，初步推斷猝滅機理為FRET或者內濾光效應（IFE）。FRET是一種通過分子間的電偶極相互作用將供體激發態能量轉移到受體的非輻射能量躍遷過程［33］。供體在能量發生轉換后，熒光強度減弱，熒光壽命縮短；受體熒光被激發，熒光壽命增加；若受體無熒光特性，則表現為供體熒光被受體猝滅［34］。而IFE是指由于熒光體的激發光譜或者發射光譜與吸收體的吸收光譜重疊，導致熒光體發射強度降低的現象，但熒光體的熒光壽命不會發生變化［36］。MnO2納米片在200 ～800 nm范圍內有寬的吸收，與CDs的發射光譜有很大的重疊，供體CDs的熒光被受體MnO2猝滅；供體CDs的熒光壽命為2.6 ns，加入受體MnO2后其熒光壽命縮短為1.7 ns（圖6）；而受體MnO2無熒光特性，表現為猝滅供體CDs的熒光。綜上所述，CDs與MnO2相互作用的機理主要為FRET。其中熒光共振能量轉移效率（E）可以由公式E= 1 -τa τ0（τa，τ0分別代表受體存在和不存在時供體的熒光壽命）獲得［25］，經計算E為34.62%。

圖5 反應機理示意圖Fig.5 Schematic diagram of the reaction mechanism

圖6 CDs和CDs/MnO2、CDs/MnO2+INH的時間分辨熒光衰減光譜Fig.6 Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs and CDs/MnO2，CDs/MnO2+INH

3 結 論

MnO2納米片與CDs之間存在的FRET效應可將CDs的熒光猝滅，而INH可將MnO2納米片還原為Mn2+，從而使CDs的熒光恢復，基于此構建了一種簡單快速地檢測INH的納米熒光探針。在優化條件下，CDs/MnO2納米探針的熒光恢復效率與INH濃度在0.5 ～60μmol/L范圍內呈線性關系，對INH的檢出限為0.02μmol/L。CDs/MnO2納米探針對INH有高選擇性，常見糖類、生物大分子和金屬離子對INH的檢測基本無干擾。該探針已成功應用于血樣、尿樣以及片劑中INH的測定，檢測結果準確可靠。CDs/MnO2納米探針靈敏度高、選擇性好、制備簡單、成本低廉且對環境友好，在臨床上能夠幫助肺結核病患者合理控制藥量，降低藥物副作用。作為一種極具應用前景的納米熒光探針，CDs/MnO2納米探針在生物醫學領域必將具有更廣泛的用途。