α-細辛醚緩解大鼠外周神經痛的作用機制研究

范煒斌 殷煒銘 張小麗 王友梅 盧洪慧 林彬

神經病理性疼痛（neuropathic pain,NP）指體感覺系統損傷或疾病導致的疼痛，通常表現為慢性的持續性或反復性疼痛，其發病率約為6.9%～10.0%[1]。NP成因和機制復雜，現有藥物對許多患者的效果并不令人滿意[2]。因此，從天然植物中尋找具有潛在抗炎和鎮痛作用的新化學物質成為鎮痛治療領域的研究方向。石菖蒲是天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖，已被證實對多種心血管疾病具有確切的防治作用[3-4]。α-細辛醚是石菖蒲根莖提取物中含量最高的具有藥用價值的化合物[5-6]，被證實可通過抑制γ-氨基丁酸轉氨酶活性以降低γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）分解代謝，上調谷氨酸脫羧酶67表達使GABA合成增加，上調γ-氨基丁酸A型受體表達以增強GABA介導的抑制功能，發揮抗癲癇作用[7-8]。NF-κB是炎性反應的核心調控分子，活化的NF-κB轉位到核內與相關DNA序列結合后誘發下游通路炎癥因子，如環氧合酶-2、TNF-α、IL-1等的轉錄和表達[9]。α-細辛醚可能通過阻斷NF-κB的活化來抑制這些炎癥因子的表達，從而緩解疼痛[10]。坐骨神經結扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠是目前公認的神經病理性疼痛模型[11-12]，本研究通過分析α-細辛醚對CCI模型大鼠行為學的影響來探討α-細辛醚的鎮痛作用及其機制，以期為開發新藥緩解NP提供參考。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 α-細辛醚購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BCA蛋白試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。Rat IL-6 ELISA試劑盒和Rat TNF-α ELISA試劑盒均購于杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為EK306/3-48和EK382/3-48；p65抗體購自Cell Signaling公司，批號：8242S；IL-6抗體購自SANTA公司，批號：SC32296；TNF-α抗體購自Abcam公司，批號：ab205587。將α-細辛醚均勻分散在0.4%吐溫-80溶液（國藥集團化學試劑有限公司）中，制成1 g/L和5 g/L的混懸液。

1.2 實驗動物 24只6～8周雄性SD大鼠，體重約220～260 g，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：20170005024951，使用許可證號：SYXK（浙）2015-0008。飼養于20～25℃、相對濕度40%～70%的實驗動物房，試驗前在動物房環境中適應1周。維持飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供，符合GB14924.3—2010執行標準。

1.3 分組、建模及給藥處理 取24只大鼠按隨機數字法分成假手術組、溶媒組、低劑量組、高劑量組，每組6只。適應性飼養后，將溶媒組大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，取左側臥位并固定于手術臺上，消毒，鋪巾，在右股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，用神經剝離子輕柔將坐骨神經與周圍軟組織分離；在坐骨神經分成3支前的主干部位游離神經7 mm左右、在距神經起始處（3支分叉處）上方2 mm處，用4.0含鉻羊腸線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm，被結扎的神經長度為4～5 mm。注意結扎的松緊度，以打結時可見肌肉輕微抽動為準；局部0.9%氯化鈉溶液沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；術畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環境自由喂養。低劑量組和高劑量組作相同處理，假手術組除不結扎坐骨神經外，其余同溶媒組。各組大鼠造模當天開始給藥，連續灌胃14 d，低劑量組、高劑量組分別給予1 g/L和5 g/L的α-細辛醚混懸液，溶媒組和假手術組均給予0.4%吐溫-80溶液，給藥劑量均為10 ml/kg。

1.4 機械痛閾測定 采用Von Frey細絲法。造模前，造模后第1、3、5、7、10、14天，用 Von Frey纖維細絲測定大鼠機械性縮足閾值（mechanical paw withdrawal threshold,MPWT）。將大鼠單獨置于一帶有金屬篩網的有機玻璃箱內適應至少20 min，使用Von Frey纖維細絲刺激大鼠右后腿足底中部。大鼠出現快速抬足遠離細絲或舔足行為視為陽性反應，反之為陰性反應。當陽性反應或陰性反應出現后，再給予相鄰小一級力度或者相鄰大一級力度的刺激，如此連續進行5次，每次刺激間隔30 s，記錄最后刺激所用的刺激強度值。

1.5 熱覺痛閾測定 采用熱板法。造模前，造模后第1、3、5、7、10、14天，將大鼠放置于熱板儀中適應30 min。之后打開熱板儀，控制溫度為52℃，放入大鼠的同時開始計時，記下當大鼠出現快速抬右足或舔足行為的時間。每只大鼠測試5次，每次間隔5 min，取平均值。行為學測試結束后，處死各組大鼠，取血清和脊髓，用于后續檢測。

1.6 大鼠脊髓p65、IL-6、TNF-α蛋白表達檢測 采用Western blot法。將各組大鼠脊髓組織分別放入裂解液中，充分勻漿后4℃11 000 r/min離心20 min，取上清為蛋白樣本。參照BCA蛋白試劑盒方法測定大鼠脊髓樣本p65、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量，以待測蛋白與β-actin的灰度值比值表示。

1.7 大鼠血清IL-6和TNF-α含量檢測 采用ELISA法。參照IL-6和TNF-α檢測試劑盒方法進行。

1.8 統計學處理 使用GraphPad Prism 5統計軟件。計量資料以表示。4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠機械痛閾的比較 與造模前比較，造模后第1天的假手術組大鼠MPWT輕微降低，溶媒組、低劑量組和高劑量組大鼠MPWT均顯著降低，并在第3天降至最小值，表明造模成功。從術后第5天起，與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組MPWT開始明顯升高（均P＜0.05），術后第7～10天MPWT顯著增加（均P＜0.05），接近假手術組水平。可見給予α-細辛醚連續灌胃減輕了CCI造模所致的神經病理性疼痛，且呈劑量相關性。見表1。

表1 4組大鼠的機械痛閾比較（g）

2.2 4組大鼠熱覺痛閾的比較 與造模前比較，造模后第1天假手術組大鼠熱覺痛閾有輕微降低，溶媒組、低劑量組和高劑量組大鼠熱覺痛閾均顯著降低（均P＜0.05）。與造模前比較，溶媒組大鼠的熱覺痛閾在術后第1天即顯著降低，并在第7～14天維持極低值。低劑量組和高劑量組大鼠的熱覺痛閾也在第7天降到了極低值，但比溶媒組高。從造模后第10天起，與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組熱覺痛閾均開始明顯升高（均P＜0.05），且高劑量組比低劑量組升高更明顯，見表2。

表2 4組大鼠的熱覺痛閾比較（s）

2.3 4組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平的比較 與假手術組相比，溶媒組p65、IL-6、TNF-α的蛋白相對表達量均顯著升高（P＜0.01）。與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α的熒光密度均降低，相比其他3組，高劑量組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α的蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）；與溶媒組相比，低劑量組p65蛋白相對表達量顯著下調（P＜0.05），但兩組IL-6和TNF-α的蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖1。

圖1 4組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α蛋白表達的比較（a：蛋白電泳圖；b-d：蛋白相對表達量）

2.4 4組大鼠血清IL-6和TNF-α質量濃度的比較與假手術組相比，溶媒組IL-6和TNF-α質量濃度均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與溶媒組相比，低劑量組IL-6和TNF-α質量濃度均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與溶媒組相比，高劑量組IL-6和TNF-α質量濃度均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 4組大鼠血清樣本IL-6和TNF-α質量濃度比較

3 討論

一直以來，炎癥和疼痛的藥物治療存在較大挑戰。目前治療NP的藥物主要有抗抑郁藥、抗驚厥藥、非甾體類抗炎藥和阿片類藥物等4種，但長期使用易造成藥物相關不良事件，顯著影響了鎮痛治療的持續性、依從性和有效性，造成患者精神和生理功能的紊亂[13]。伴隨著現代藥理學與制劑技術的發展，越來越多的研究人員轉向傳統中草藥研究，尋找新的治療炎癥及疼痛的天然藥物[14-15]。

炎癥是機體應對微生物病原體感染以及物理、化學刺激而發生的生理防御過程，受一系列炎癥介質和細胞因子的嚴格調節；受到疼痛刺激時，機體內單核細胞選擇性運輸到刺激部位，并分化為促炎巨噬細胞，產生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和其他炎癥介質來促進組織炎癥[16-17]。TNF-α和IL-6是炎癥發生時的主要促炎細胞因子，觸發初級傳入傷害感受器的激活，導致痛覺過敏[18]。

NF-κB信號通路是調節細胞增殖、生長、分化，參與炎癥反應的關鍵信號通路，在慢性炎癥疾病和神經病理性疼痛中發揮了重要的調控作用。p65常與核因子κB抑制蛋白α（I-kappa-B-alpha,IκBα）以同源或異源二聚體形式構成炎癥主要調節轉錄因子NF-κB；受到外界刺激時，IκBα通過蛋白酶體途徑參與NF-κB和p65的磷酸化，并發生水解，NF-κB易位到細胞核中，隨后激活參與細胞生長、分化和存活的多個下游基因的表達[19]。本研究發現：α-細辛醚處理后大鼠脊髓和血清中TNF-α和IL-6相對表達量均顯著下調，脊髓中p65相對表達量顯著下調。此外，α-細辛醚抑制了CCI誘導的p65磷酸化，進而消除NF-κB作用，抑制IL-6和TNF-α的產生；隨劑量加大，抑制程度上升。這提示α-細辛醚可能通過阻斷NF-κB信號通路的激活發揮治療神經病理性疼痛的作用，且具有一定劑量依賴的特性。

α-細辛醚是中國傳統藥材石菖蒲的主要活性化合物，已被證實具有多種生物學功能[20-21]，如抗氧化、抗抑郁、抗焦慮、抗癲癇、抗腫瘤作用等。Sutariya等[10]發現：α-細辛醚對腎病綜合征有治療作用，在多柔比星誘導的腎病綜合征中，α-細辛醚能顯著抑制蛋白尿，降低膽固醇和甘油三酯并改善腎小球硬化。這種作用也是通過抑制NF-κB通路，下調IL-6、TNF-α等炎癥標志物來介導的。

本研究初步證實了石菖蒲提取物α-細辛醚的抗炎活性，其機制可能是通過抑制NF-κB通路，抑制p65、IL-6、TNF-α的表達而產生鎮痛作用。α-細辛醚很可能成為鎮痛藥物的候選藥物之一。