厚樸酚納米結構脂質載體的制備及其體內藥動學研究

許麗娜李曉蒙談秀鳳

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校，河南 鄭州450064； 2.上海中醫藥大學，上海201203）

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils 或凹葉厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils 的干燥干皮、根皮及枝皮，主要有效成分是厚樸酚，具有中樞神經抑制、抗氧化、抗炎、治療心肌損傷、抗腫瘤等活性［1-2］，但在37 ℃下的溶解度僅為10.60 μg／mL［3］，存在溶出受限、生物利用度低等問題。劉會珍等［4］通過酚磷脂復合物來改善厚樸酚溶出度及生物利用度，但該制劑黏性大，而且胃腸道水相、pH 值、酶等均會影響其穩定性［5］，藥物溶出度、生物利用度改善程度有限；張曉千等［6］制備的厚樸酚PLGA 納米粒包封率僅為75.36%，仍存在一定的提升空間。

納米結構脂質載體是在固體脂質納米粒基礎上發展而來的一種新型納米給藥技術，具有穩定性好、載藥量高等特點［7-9］，可促進藥物體外溶出，提高體內口服吸收生物利用度［10］。本實驗對厚樸酚納米結構脂質載體處方進行優化，觀察其形態，測定粒徑、Zeta 電位、包封率、載藥量、體外溶出情況，并研究其體內藥動學，期相關制劑學研究提供新策略。

1 材料

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器，美國安捷倫公司）；MS205DU／A 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HCJ-4E 型恒溫水浴磁力攪拌器（常州郎越儀器有限公司）；TL-150Y 型超聲波細胞粉碎機（江蘇天翔儀器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；DCY-12G 型干式氮氣吹掃儀（金昌實驗儀器公司）；TG16-G 型臺式高速離心機（常州市億能實驗儀器廠）。

厚樸酚對照品（批號110729-201807，純度98.7%，中國食品藥品檢定研究院）；厚樸酚原料藥（批號191228，純度98%，南京澤朗醫藥科技有限公司）。單硬脂酸甘油酯（批號181012，國藥集團化學試劑有限公司）；超濾離心管（截留分子量12 000～14 000 Da，美國Millipore 公司）；辛癸酸甘油酯（批號20190415，上海泰坦科技股份有限公司）；大豆磷脂（批號20180914PC，上海太偉藥業有限公司）；泊洛沙姆 188（批 號156544891，德國BSF 公司）。SD 大鼠購自河南省動物實驗中心，體質量（280±20）g，動物生產許可證號SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結果

2.1 厚樸酚含量測定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相甲醇-水（60∶40）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長294 nm。

2.1.2 線性關系考察 稱取厚樸酚對照品10.0 mg，轉移至25 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解，放置至室溫后甲醇定容至刻度，得到400.0 μg／mL 貯備液，流動相依次稀釋至50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.05 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以厚樸酚峰面積（Y）對質量濃度（X）進行回歸，得方程為Y＝21.687 9X ＋0.987 2（r＝0.999 9），在0.05～50 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取納米結構脂質載體混懸液1 mL 至50 mL 量瓶中，甲醇超聲破乳30 s，流動相定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 方法學考察 取同一批納米結構脂質載體混懸液，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚峰面積RSD 為1.46%，表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得厚樸酚峰面積RSD為0.29%，表明儀器精密度良好。取同一份供試品溶液，于0、3、6、12、18、24 h 在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚峰面積RSD為0.52%，表明溶液在24 h 穩定性良好。取1 mL厚樸酚含量已知的納米結構脂質載體混懸液至50 mL量瓶中，平行9份，加入“2.1.2”項下對照品溶液1.0、1.25、1.5 mL 各3份，甲醇超聲破乳30 s，流動相定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚平均加樣回收率分別為99.32%、100.15%、100.27%，RSD 分別為1.19%、1.42%、0.75%。

2.2 納米結構脂質載體制備 采用熔融-超聲乳化法。取50 mg 厚樸酚至圓底燒瓶中，加入處方量固態、液態脂質，75 ℃水浴磁力攪拌至藥物完全溶解，作為油相；取處方量泊洛沙姆188、大豆磷脂至100 mL 蒸餾水中，75 ℃水浴磁力攪拌溶解，作為水相，在攪拌條件下將油相滴加至水相中，滴完后再敞口攪拌3 h 以除盡有機溶劑，蒸餾水補足體積至100 mL，將圓底燒瓶固定于鐵架臺上，置于超聲儀中，在一定功率下超聲處理10 min（每工作3 s 間隔1 s），迅速置于-15 ℃冰箱中10 min，取出，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 包封率、載藥量的測定 取1 mL 納米結構脂質載體混懸液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算總含量（m總）。取1 mL 納米結構脂質載體混懸液至超濾管中（截留分子量12 000～14 000 Da），-4 ℃、12 000 r／min 離心25 min［11］，取續濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測定厚樸酚游離量（m游離）。參考文獻［8］報道，計算包封率、載藥量。

2.4 粒徑、Zeta 電位測定 取0.1 mL 納米結構脂質載體混懸液，加蒸餾水至4 mL，混勻后置于比色皿中，在粒度分析儀上測定粒徑、Zeta 電位。

2.5 處方篩選

2.5.1 固態脂質種類 固定液態脂質為辛癸酸甘油酯，固液脂質比為4∶1，藥脂比為1∶18，泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶1，表面活性劑用量為1%，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸＋單硬脂酸甘油酯（1∶1）制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表1。由此可知，硬脂酸作為固態脂質時平均粒徑較小，但包封率、載藥量、Zeta 電位絕對值較低；硬脂酸＋單硬脂酸甘油酯（1∶1）制備時上述指標均不如單硬脂酸甘油酯。最終，選擇單硬脂酸甘油酯作為固態脂質。

2.5.2 液態脂質種類 固定固態脂質為單硬脂酸甘油酯，固液脂質比為4∶1，藥脂比為1∶18，泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶1，表面活性劑用量為1%，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以大豆油、辛癸酸甘油酯、大豆油＋辛癸酸甘油酯（1∶1）制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表2。由此可知，大豆油作為液態脂質時包封率、載藥量、Zeta 電位絕對值較低，粒徑較大；大豆油＋辛癸酸甘油酯（1∶1）制備時上述指標均不如單用辛癸酸甘油酯。最終，選擇辛癸酸甘油酯作為液態脂質。

表2 液態脂質種類對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.2 Effects of liquid lipid type on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

2.5.3 固液脂質比 固定藥脂比為1∶18，泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶1，表面活性劑用量為1%，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以固液脂質比3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1 制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表3。由此可知，當兩者比例為4∶1 時包封率、載藥量最大，粒徑較小，Zeta 電位絕對值大于30 mV。最終，選擇4∶1作為固液脂質比。

表3 固液脂質比對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.3 Effects of solid-liquid lipid ratio on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

2.5.4 藥脂比 固定泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶1，表面活性劑用量為1%，固液脂質比為4∶1，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以藥脂比1∶12、1∶15、1∶18、1∶20、1∶22制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表4。由此可知，兩者比例為1∶20 時包封率、載藥量、Zeta 電位絕對值相對最大，粒徑較小。最終，選擇1∶20 作為藥脂比。

2.5.5 泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例 固定藥脂比為1∶20，固液脂質比為4∶1，表面活性劑用量為1%，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例1.5∶1、0.5∶1、1∶1、1∶0.5、1∶1.5 制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表5。由此可知，改變泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例時粒徑變化較大，而載藥量、包封率、Zeta 電位絕對值無明顯變化規律，程度也不大。最終，選擇1∶0.5 作為泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例，此時粒徑最小，Zeta 電位絕對值最大，載藥量、包封率理想。

表5 泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.5 Effects of Poloxamer 188-phospholipid ratio on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

2.5.6 表面活性劑用量 固定藥脂比為1∶20，固液脂質比為4∶1，泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶0.5，超聲功率為300 W，超聲時間為20 min，分別以表面活性劑用量0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表6。由此可知，隨著表面活性劑用量增加，包封率、載藥量均呈先升后降的趨勢，而粒徑恰好相反；當其用量為1.0%時，包封率、載藥量、Zeta 電位最大，粒徑較小。最終，選擇1.0%作為表面活性劑用量。

表6 表面活性劑用量對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.6 Effects of surfactant consumption on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

2.5.7 超聲功率 固定藥脂比為1∶20，固液脂質比為4∶1，泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例為1∶0.5，表面活性劑用量為1.0%，超聲時間為20 min，分別以超聲功率250、300、350、400 W制備納米結構脂質載體，測定包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位，結果見表7。由此可知，超聲功率較低時粒徑較大，而較高時會影響包封率、載藥量、Zeta 電位絕對值。最終，選擇350 W 作為超聲功率。

表7 超聲功率對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.7 Effects of ultrasonic power on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

2.6 驗證試驗 根據“2.5”項下結果，確定最優處方為取50 mg 厚樸酚至圓底燒瓶中，按照藥脂比1∶20、固液脂質比4∶1 加入單硬脂酸甘油酯、大豆油，再加入50 mL 無水乙醇，75 ℃水浴磁力攪拌溶解，作為有機相；以泊洛沙姆188 與大豆磷脂比例1∶0.5，表面活性劑用量1.0%制備100 mL溶液，75 ℃水浴磁力攪拌溶解，作為水相，邊攪拌邊將有機相滴加至水相中，滴完后再敞口攪拌3 h，將圓底燒瓶固定于鐵架臺上，置于超聲儀中，在功率350 W 下超聲處理20 min（每工作3 s 間隔1 s），迅速置于-15 ℃冰箱中15 min，取出，過0.45 μm 微孔濾膜，蒸餾水補加體積至100 mL。再按照上述優化處方進行3 批驗證試驗，測得納米結構脂質載體的平均包封率、載藥量分別為（84.09±1.13）%、（3.92±0.17）%。

2.7 處方表征

2.7.1 透射電鏡（TEM）取納米結構脂質載體混懸液0.5 mL，加入50 mL 蒸餾水后滴加于銅網上，室溫晾干，2%磷鎢酸染色5 min 后觀察形態，結果見圖1。由此可知，納米結構脂質載體球形，粒子之間無粘連現象。另外，TEM 觀察到的是干燥納米粒的粒徑，而激光粒度儀測得的是水化粒徑，故前者小于后者。

圖1 納米結構脂質載體TEM圖Fig.1 TEM image for nanostructured lipid carriers

2.7.2 粒徑、Zeta 電位 取納米結構脂質載體混懸液0.5 mL，加入50 mL 蒸餾水，測定粒徑、Zeta電位，結果見圖2～3。由此可知，平均Zeta 電位為（-34.2±0.8）mV，粒徑為（177.59±5.18）nm，PDI 為0.062±0.006。

圖2 納米結構脂質載體Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanostructured lipid carriers

圖3 納米結構脂質載體粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of nanostructured lipid carriers

2.8 凍干粉制備 取納米結構脂質載體混懸液適量，加入5% 乳糖混勻，分裝于5 mL 西林瓶中，在-60 ℃下預凍2 d，封口膜封口后戳6 個小孔，置于-30 ℃冷凍干燥儀中，抽真空后保存3 d，即得。取3 批凍干粉，蒸餾水復溶，測得平均包封率為（79.26±1.03）%，載藥量為（3.61±0.16）%，粒徑為（203.56±8.70）nm，Zeta 電位為（-29.6±0.6）mV。

2.9 體外釋藥研究 采用透析袋法，測得厚樸酚在0.5% 十二烷基硫酸鈉溶液中的溶解度為36.64 μg／mL，達到原料藥漏槽條件，故釋放介質選擇1 000 mL 該溶液，并設定攪拌槳轉速為75 r／min，溫度為（37±1）℃。取凍干粉（厚樸酚含量為5 mg）適量，加入3 mL 空白介質，轉移至透析袋中，兩端扎緊；取相同量厚樸酚，加入3 mL 空白溶出介質，同法操作，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12、18、24、30、36 h 各取樣3 mL，同時注入3 mL 空白介質，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，測定累積溶出度，結果見圖4。由此可知，原料藥36 h 內累積溶出度僅為38.96%，可能是其本身顆粒較大，疏水性較強所致［12］；納米結構脂質載體后在不同時間點的累積溶出度均得到顯著提高，36 h 內為78.62%。

圖4 藥脂比對包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.4 Effects of drug-lipid ratio on encapsulation efficiency，drug loading，particle size and Zeta potential（n＝3）

圖4 厚樸酚體外溶出曲線（n＝6）Fig.4 In vitro dissolution curves for magnolol（n＝6）

2.10 體內藥動學研究

2.10.1 藥液制備 取厚樸酚及其納米結構脂質載體凍干粉適量，0.5% CMC-Na 溶液配制，即得（以厚樸酚計，質量濃度為3 mg／mL）。

2.10.2 分組、給藥與采血 12 只大鼠禁食12 h，自由飲水，隨機分為厚樸酚組、厚樸酚納米結構脂質載體組，每組6只，按60 mg／kg 劑量灌胃給予“2.10.1”項下藥液，麻醉后于0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血，置于肝素化離心管中，3 000 r／min 離心2 min，取上清液，保存于-15 ℃冰箱中。

2.10.3 血漿樣品處理 參考文獻［6］報道，取內標溶液（稱取葛根素對照品20 mg，溶于100 mL甲醇中，取適量繼續用甲醇稀釋至200 ng／mL，即得）、解凍血漿樣品各100 μL，置于離心管中，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋提取5 min，5 000 r／min 離心5 min，分離上層有機相至空白離心管中，45 ℃氮吹儀緩慢吹干得殘渣，100 μL 甲醇復溶（將剪去的蓋子扣上），混勻，轉移至一次性內襯管中待測。

2.10.4 血漿對照品溶液制備 取厚樸酚對照品適量，甲醇制成 1 600、800、400、200、100、20 ng／mL溶液，分別取100 μL 至離心管中，45 ℃氮吹儀吹去甲醇，于殘渣中加入100 μL 空白血漿，渦旋混勻，按“2.10.3”項下方法處理，即得。

2.10.5 線性關系考察 取血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以厚樸酚、內標峰面積比值為縱坐標（Y），厚樸酚質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝0.027 9X＋7.415 3（r＝0.993 2），在20～1 600 ng／mL 范圍內線性關系良好。

2.10.6 方法學考察 取血漿樣品適量，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚、內標峰面積比值RSD 為4.82%，表明樣品在24 h 內穩定性良好。取20、400、1 600 ng／mL 血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定3次，測得厚樸酚、內標峰面積比值RSD 分別為9.62、4.35%、3.84%，表明儀器精密度良好。取20、400、1 600 ng／mL 血漿對照品溶液各3份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為88.14%、93.36%、90.51%，RSD 分別為4.65%、3.11%、4.07%。取20 ng／mL 血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得定量限（S／N ＝10）、檢測限（S／N＝3）分別為5.0、1.5 ng／mL。

2.10.7 結果分析 厚樸酚血藥濃度-時間曲線見圖5，主要藥動學參數見表8。由此可知，原料藥在12 h 時血藥濃度已低于20 ng／mL，但同一時間點納米結構脂質載體仍高于50 ng／mL；與原料藥比較，納米結構脂質載體tmax、t1／2延長（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度增加至4.06 倍。

圖5 厚樸酚血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig.5 Drug concentration-time curves for magnolol（n＝6）

表8 厚樸酚主要藥動學參數（， n＝6）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for magnolol（， n＝6）

表8 厚樸酚主要藥動學參數（， n＝6）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for magnolol（， n＝6）

注：與厚樸酚比較，**P＜0.01。

3 討論

前期報道，只采用固態脂質作為厚樸酚納米載體時，包封率往往較低［5-6］，故本實驗聯合應用固液脂質載體，包封率達（84.09±1.13）%，可能是由于它有利于形成晶體缺陷空間，可更有效地包裹藥物，但液態脂質比例過高反而會影響載藥量、粒徑、Zeta 電位，甚至可能發生相分離［8］，故最終確定固液脂質比為4∶1。包封率與脂質載體總用量呈正比，但達到一定程度后繼續增加后者則會對載藥量、粒徑等產生不利影響，最終確定藥脂比為1∶20。較高濃度的表面活性劑由于增溶作用，可使藥物進入水相，從而減少被包載藥物量，導致其包封率、載藥量降低［8］，并會影響體系的乳化效果，進而影響粒徑［9］，最終確定表面活性劑用量為1.0%。為確保納米制劑的穩定性，其Zeta 電位絕對值應大于30 mV，課題組前期只采用泊洛沙姆188 作為乳化劑，所制得納米結構脂質載體Zeta 電位絕對值在20 mV 左右，而聯合應用泊洛沙姆188、大豆磷脂時其數值有所升高，可能是由于磷脂額外提供負電荷屏障，協同泊洛沙姆的空間位阻作用，有助于增加粒子之間的排斥力［13］，從而改善穩定性。

大鼠灌胃給藥后，納米結構脂質載體tmax顯著延長，可能是它具有較強的粘附性，易附著于胃腸道壁，從而增加滯留時間。文獻［5-6］報道，厚樸酚PLGA 納米粒、磷脂復合物、固體分散體、固體脂質納米粒相對口服生物利用度提高至1.38～3.45倍，而本實驗所制得納米結構脂質載體可提高至4.06倍［14］，可能是由于它可增加厚樸酚溶出度、體內滯留時間、藥物與胃腸道接觸面，從而有助于藥物充分吸收［15-16］，并且處方中液態脂質也有該作用［14］。

另外，采用泊洛沙姆188、磷脂作為乳化劑時，兩者可附著于粒子表面。由于泊洛沙姆188 具有親水性，磷脂同時具有親脂性和親水性，推測它們可能會對納米結構脂質載體透膜吸收進入血液循環產生積極影響［16］。