濕疹康凝膠制備工藝優化及質量評價

雷雅婷 張也劉隆基黃丹羅堃嚴建業*李順祥*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙410208； 2.湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙410208）

濕疹，中醫又稱為“濕瘡”［1］，大約有20%的兒童及10%的成人患有本病［2］，隨著生活水平提高及生活方式、體質差異、環境改變，其發病率近年來有上升趨勢［3］。目前，治療濕疹，特別是嬰幼兒濕疹尚無特效藥，西醫大多采用皮質類固醇、免疫抑制劑等［4］，雖能有效改善癥狀，但易復發，不良反應較多，而中藥具有不良反應少可有效減少復發、價格低廉等優點。

濕疹康油劑是湖南中醫藥大學附屬中西醫結合醫院用于治療濕疹的臨床驗方，由蛋黃油、苦參生物堿提取物、冰片等組成，臨床療效肯定，而且無任何不良反應，但存在易弄臟衣物、使用不便、生物利用度低等缺點，前期課題組已將其制成凝膠劑，對改善其生物利用度和用藥依從性、提高臨床療效具有重要意義。

本實驗在單因素試驗基礎上，采用星點設計-效應面法［5］來優化濕疹康凝膠制備工藝，再通過HPLC 法對具有抗菌、抗炎、免疫調節等生物活性的苦參堿、氧化苦參堿進行含量測定［6］，以期為該制劑開發利用奠定基礎，也為臨床治療嬰幼兒濕疹、濕疹性皮炎提供安全高效的外用新型制劑。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 色譜儀（美國Waters 公司）；KQ5200DV 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP224C 分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；數顯電動攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；WGL-230B 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；PHS-3C 型PH 計（杭州齊威儀器有限公司）；NDJ-8s 數顯黏度計（上海越平科學儀器有限公司）；ELGA 超純水系統（英國ELGA Lab Water 公司）。

1.2 試劑與藥物 3 批濕疹康凝膠劑（自制，批號20191103、20191104、20200706）。鮮雞蛋（批號20191021、20200319，南縣頂香蛋雞養殖專業合作社）。苦參（批號20190807，眾益堂中藥材銷售有限公司）、冰片（批號20181107，福建省青松股份有限公司）經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定，分別為豆科植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根、合成冰片。苦參堿（批號110805-201709，純度≥98%）、氧化苦參堿（批號110780-201508，純度≥98%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈、無水乙醇為色譜純，購于美國Merck 公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 凝膠劑制備 取鮮雞蛋適量，煮熟取蛋黃，過24 目篩制粒，鼓風干燥直至無水分逸出，取適量至圓底燒瓶中，加8、6 倍量95%乙醇回流提取2次，時間分別為2、1.5 h，紗布過濾，合并2 次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，得到蛋黃油。

取苦參粗粉適量，加10、8 倍量60%乙醇超聲提取2次，時間分別為1.5、1 h，棉花過濾，合并2 次濾液，濾液加1% HCl 調節pH 至3～4，抽濾，棄去沉淀；酸水液加10% NaOH 調節pH至10～11，抽濾，棄去沉淀；堿水液濃縮，置于烘箱中干燥，得浸膏，加水分散，棄去不溶物，三氯甲烷萃取3次，棄去水層，合并三氯甲烷層，回收三氯甲烷至干，于烘箱干燥，得到苦參生物堿提取物。

取適量甘油至干燥燒杯中，加入卡波姆940 攪拌均勻，再加入超純水充分溶脹，作為基質Ⅰ，靜置過夜；將冰片加到蛋黃油中，攪拌均勻，作為基質Ⅱ，將基質Ⅰ加到基質Ⅱ中，攪拌均勻，滴加聚山梨酯80，攪拌均勻，滴加丙二醇，攪拌均勻，加入溶有苦參生物堿提取物、山梨酸鉀的超純水，攪拌均勻，三乙醇胺調節pH 至6～7，一直攪拌直至呈乳膠狀，即得。

2.2 評價指標確定

2.2.1 外觀 凝膠外觀應光滑，均勻細膩，無分層，無團塊，無氣泡，各項指標均理想者為5分，根據均勻度、有無分層、有無團塊氣泡及其大小給予不同分數。

2.2.2 理化性質

2.2.2.1 黏度 在室溫（25 ℃）下測定黏度，選用3號轉子，設定轉速為1.5 r／min，黏度在40 000～50 000 mPa·s 范圍內者為5分，根據其實際數值給予不同分數。

2.2.2.2 粘附力 按照NaKamura［7］報道的方法，將100 g 熱瓊脂（1%）或黏蛋白（2%）溶液（溶劑為pH ＝7.0 的磷酸鹽緩沖液）均勻涂抹于20 cm×20 cm 的玻璃板上，在4～8 ℃下放置3 h，在溫度22 ℃、相對濕度77%下平衡1 h，再將凝膠滴于玻璃板的一端并呈90°放置，測定在0.5、1、2、3、4、5 h 的移動距離，最小者為5分，根據其實際數值給予不同分數。

2.2.2.3 涂展性 凝膠應易涂于皮膚上，能快速鋪展，無油膩感，較為舒適，各項指標均理想者為5分，根據鋪展難易、速度、舒適感給予不同分數。

2.2.2.4 pH值在室溫（25 ℃）下取凝膠2 g，加入20 mL水，正反方向攪拌5 min，測定pH值，在6～7 范圍內者為5分，根據其實際數值給予不同分數。

2.2.2.5 保濕率 參考文獻［8］報道，精密稱取凝膠適量，干燥至恒定質量m0，均勻涂布于載玻片上，置于溫度（25±1）℃、相對濕度（43.16±0.39）%的恒溫恒濕密閉干燥器中24 h 后取出，精密稱定質量mt，計算保濕率，公式為保濕率＝（mt／m0）×100%，最高值者為5分，根據其實際數值給予不同分數。

2.2.3 穩定性 參考文獻［9］報道。

2.2.3.1 離心穩定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，3 000 r／min 離心15 min，有分層現象為0分；未分層者繼續離心15 min，有分層現象為1分；未分層者繼續離心15 min，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.2 耐熱穩定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，50 ℃恒溫箱內放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.3 耐寒穩定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，-20 ℃冰箱中放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.4 耐冷穩定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，4 ℃冰箱中放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.4 綜合評分計算 凝膠外觀應光滑細膩，具有一定的黏度，能粘附在皮膚上，使有效成分更充分地發揮藥效，在常溫時保持膠狀，不干涸或液化，并在運輸貯存過程中要具有一定的穩定性。因此，對“2.2.2”“2.2.3”項下指標賦予權重，公式分別為理化性質＝（黏度評分＋粘附力評分＋涂展性評分＋pH 評分＋保濕率評分）× 20%、穩定性＝（離心穩定性評分＋耐熱穩定性評分＋耐寒穩定性評分＋耐冷穩定性評分）× 25%，綜合評分＝外觀× 0.2 ＋理化性質× 0.5 ＋穩定性× 0.3。

2.3 單因素試驗 按“2.1”項下方法，改變凝膠劑中某一種物料成分的用量，固定其他用量不變，制備凝膠劑［10］，以“2.2.4”項下綜合評分為指標，對卡波姆940、蛋黃油、甘油、聚山梨酯80、丙二醇用量、pH 值進行考察，發現卡波姆940、蛋黃油、聚山梨酯80 用量對制備工藝的影響較大，三者范圍分別為0.9%～1.1%、40%～60%、2%～5%。

2.4 星點設計-效應面法 在單因素試驗基礎上，選擇卡波姆940 用量（X1）、蛋黃油用量（Χ2）、聚山梨酯80 用量（X3）作為影響因素，“2.2.4”項下綜合評分（Y）作為評價指標，星點設計-效應面法［11］優化制備工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 數據進行多元回歸擬合，得到方程為Y＝4.82 ＋0.000X1-0.39X2＋ 0.19X3＋ 0.025X1X2-0.025X1X3＋0.050X2X3-0.，方差分析見表3。由此可知，模型F為109.75，P＜0.000 1，表明其影響極顯著；失擬項P＝0.788 0＞0.05，表明模型無失擬現象，可用于預測。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析［12］，結果見圖1。由此可知，綜合評分隨著卡波姆、蛋黃油、聚山梨酯80 用量增加均呈先升后降的趨勢，以蛋黃油、聚山梨酯80 用量更明顯。最終確定，最優工藝卡波姆940 用量1.00%，蛋黃油用量47.59%，聚山梨酯80 用量4.13%。

圖1 各因素響應面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

再按照上述優化工藝平行制備3 份凝膠，進行驗證試驗，結果見表4。由此可知，綜合評分與預測值接近，偏差均小于2%，表明模型預測性良好，工藝穩定可行。

表4 驗證試驗結果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests（n＝3）

2.5 質量評價

2.5.1 外觀性狀觀察 根據2020 版《中國藥典》四部制劑通則0114［13］，發現凝膠均勻細膩，在常溫下保持凝膠狀，不干涸或液化，黏度適中，易涂布于皮膚，不下沉、結塊。

2.5.2 pH 值測定 取3 批凝膠至燒杯中，每批2 g，加20 mL 超純水攪拌5 min，測定pH，每批3次，測得平均pH 值分別為6.47、6.52、6.50。

2.5.3 離心穩定性考察 取3 批凝膠至10 mL 離心管中，每批5 g，3 000 r／min 離心30 min 后取出，發現無分層、藥物析出、出現沉淀等現象，表明制劑離心穩定性良好。

2.5.4 黏度測定 在室溫（25 ℃）下測定3 批凝膠黏度，選用3 號轉子，設定轉速為1.5 r／min，測得黏度均在40 000～50 000 mPa·s 范圍內。

2.6 苦參堿、氧化苦參堿含量測定

2.6.1 色譜條件 Hypersil HN2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-無水乙醇-3%磷酸，梯度洗脫，程序見表5；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量10 μL。

表5 梯度洗脫程序Tab.5 Gradient elution programs

2.6.2 對照品溶液制備 分別精密稱取對照品苦參堿0.006 2 g、氧化苦參堿0.006 0 g，加入3 mL乙腈，制成兩者質量濃度分別為2.07、2.00 mg／mL的貯備液，分別吸取36、113 μL，乙腈定容至3 mL，即得（苦參堿、氧化苦參堿質量濃度分別為25、75 μg／mL）。

2.6.3 供試品溶液制備 參考文獻［14］報道，精密稱取凝膠1.0 g，置于具塞三角錐形瓶中，加濃氨試液l mL、三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質量，超聲提取40 min，放冷，三氯甲烷補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液至蒸發皿中，蒸干，殘渣加無水乙醇超聲溶解，轉移至25 mL 量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.6.4 陰性樣品溶液制備 精密稱取缺苦參堿、氧化苦參堿的陰性樣品1.0 g，按“2.6.3”項下方法制備，即得。

2.6.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2。由此可知，供試品溶液色譜圖在對照品溶液相應位置有相同色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.6 方法學考察

2.6.6.1 線性關系考察 精密吸取不同質量濃度對照品溶液各10 μL，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，得苦參堿、氧化苦參堿方程分別為Y＝5 247.4X-5 147.9（r＝1.000 0）、Y＝4 831.4X-13 230（r＝0.999 9），分別在2.5～50.0、7.5～150.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.6.6.2 精密度試驗 精密稱取凝膠適量，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得苦參堿、氧化苦參堿峰面積RSD 分別為0.56%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.6.3 重復性試驗 精密稱取同一批凝膠，按“2.6.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，測得苦參堿、氧化苦參堿含量RSD 分別為1.51%、1.91%，表明該方法重復性良好。

2.6.6.4 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得苦參堿、氧化苦參堿峰面積RSD 分別為1.16%、1.94%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6.6.5 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的凝膠6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入一定量對照品溶液，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，計算回收率。結果，苦參堿、氧化苦參堿平均加樣回收率分別為96.66%、99.33%，RSD 分別為0.90%、2.13%。

2.6.7 樣品含量測定 精密稱取3 批凝膠，每批1.0 g，平行3份，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下各進樣測定10 μL，計算含量，結果見表6。

表6 各成分含量測定結果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

在給藥系統制備工藝優化中，常需考察多個因素的多個水平，為減少試驗次數，并考察不同因素之間的相互作用［15］，本實驗在單因素試驗基礎上，采用星點設計-效應面法優化濕疹康凝膠制備工藝，發現卡波姆940、蛋黃油、聚山梨酯80 用量過少或過多都會影響黏度、涂展性、細膩度等。驗證試驗表明，按最優工藝制備的濕疹康凝膠劑綜合評分高，而且與預測值接近，表明模型擬合度高，具有良好的預測能力，為該制劑開發提供了可靠的科學依據。

苦參堿、氧化苦參堿作為苦參主要有效成分，具有抗皮膚炎癥和變態反應、防止皮膚疤痕形成等作用，臨床上廣泛用于濕疹治療［16］。本實驗采用HPLC 法同時對最優工藝所制得濕疹康凝膠中苦參堿、氧化苦參堿含量進行測定，發現該方法專屬性強，準確可靠，簡便快速，可用于該制劑質量控制，并為其質量標準的制定奠定了基礎。