UPLC-MS／MS 法同時測定感冒清熱顆粒中4 種成分

劉曉俊郭文婷沈鵬程龍

（1.昆明市食品藥品檢驗所藥品檢驗中心，云南 昆明650032； 2.昆明學院化學化工學院，云南 昆明650214； 3.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海200335）

感冒清熱顆粒由荊芥穗、防風、柴胡、葛根、白芷等11 味藥材組成，具有疏風散寒、解表清熱的功效，方中葛根所含葛根素具有解肌退熱、生津止渴［1］、抗炎、抗過敏［2-5］等作用；白芷所含歐前胡素具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、平喘、抗菌等多種藥理作用［6-11］；防風指標成分為升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷，前者具有鎮(zhèn)靜、抗菌、降壓等作用，后者具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種功效［12-14］。2020年版《中國藥典》 一部對感冒清熱顆粒的質(zhì)量控制以薄層鑒別為主，僅對葛根中葛根素含量采用HPLC 法進行測定，并未涉及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素等其他有效成分，不能全面反映該制劑質(zhì)量，而文獻［13-21］也大多僅采用HPLC 法分別測定葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素含量。本實驗采用UPLC-MS／MS 法同時測定感冒清熱顆粒中葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素的含量，以期為全面評價該制劑質(zhì)量、完善其標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；AB SCIEX 三重四級桿／復合線性離子阱質(zhì)譜儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）；AL104 電子分析天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；DV215CD 十萬分之一微量分析天平（美國奧豪斯公司）；Chorus LC216-134 超純水制備儀［威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司］；SONOREXRK 255 超聲波清洗器（德國Bandelin 公司）。

1.2 試劑與藥物 葛根素（批號110752-200912，純度96.0%）、歐前胡素（批號110826-201616，純度99.6%）、5-O-甲基維斯阿米醇 苷（批號111523-201208，純度96.4%）、升麻素苷（批號111522-201008，純度93.9%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。3 批感冒清熱顆粒分別來自廣西維威制藥有限公司（批號181214，含蔗糖，12 g／袋）、廣東恒誠制藥有限公司（批 號1811207，含蔗糖，12 g／袋）、葵花藥業(yè)集團（冀州）有限公司（批號18022301，無蔗糖，6 g／袋）。甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.2 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 質(zhì)譜條件 SCIEX 4000 Q TRAP 三重四級桿／復合線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)；電噴霧離子源（ESI源），溫度550 ℃，電壓5.5 kV；正離子模式；噴霧氣（Gas1）55 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助加熱氣（Gas2）55 psi；氣簾氣（CUR）30 psi，其他參數(shù)見表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品葛根素10.23 mg、升麻素苷10.07 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷10.04 mg、歐前胡素10.06 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密吸取2 000、250、125、125 μL，置于同一250 mL 量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為7 857.00、946.00、484.00、501.00 ng／mL）。

圖1 各成分UPLC-MS／MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.4 供試品溶液制備 取各批樣品適量，研細，6 g／袋取約0.4 g，12 g／袋取約0.8 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，20%甲醇超聲（頻率33 kHz、功率250 W）處理30 min，冷卻，20%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1.0 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項下對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再以信噪比為10∶1 計算定量下限（LOQ），結(jié)果分別為葛根素8.27 pg、升麻素苷7.39 pg、歐前胡素5.22 pg、5-O-甲基維斯阿米醇苷5.63 pg；以信噪比為3∶1 計算檢測下限（LOD），結(jié)果分別為葛根素2.48 pg、升麻素苷2.22 pg、歐前胡素1.57 pg、5-O-甲基維斯阿米醇苷1.69 pg。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 取“2.5”項下對照品溶液（葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素質(zhì)量濃度分別為1 571.40、189.20、96.80、100.20 ng／mL），0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定6次，測得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素峰面積RSD 分別為0.92%、1.29%、0.98%、1.32%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（批號18022301），室溫下 于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定，測得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素峰面 積 RSD 分別為 1.91%、1.46%、1.31%、1.73%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗 取同一批本品（批號18022301）6份，每份約0.4 g，精密 稱定，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定，測得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素含量RSD分別為1.41%、0.97%、1.18%、1.16%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批本品（批號18022301）6份，每份約0.2 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，精密加入“2.3”項下對照品溶液（982.08 μg／mL 葛根素1 000 μL、945.57 μg／mL 升麻素苷60 μL、967.86 μg／mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷60 μL、1 001.98 μg／mL 歐前胡素300 μL），按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表4。2.10 樣品含量測定 取3 批樣品各2份，其中批號18022301 約0.4 g，批號181214、1811207 各約0.8 g，精密稱定，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表5。

表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表5 各成分含量測定結(jié)果（n＝2）Tab.5 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 討論

3.1 測定方法選擇 課題組前期采用HPLC 法測定感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，發(fā)現(xiàn)歐前胡素色譜峰保留時間較長，含量較低，在供試品中未能檢出；本實驗采用UPLC-MS／MS法，上述4 種成分均能準確定量，并且具有分析時間短、準確度高、靈敏度高的優(yōu)勢。

3.2 流動相選擇 本實驗比較了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸，發(fā)現(xiàn)以后者洗脫時保留時間短，各成分離子強度高，分離程度、峰形更理想，故以其為流動相。

3.3 含量分析 3 個廠家感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素含量穩(wěn)定，均能達到藥典標準，但升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量差異較大，分別達3.5、4.5倍，可能是藥材質(zhì)量差異、生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定所致，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實驗建立UPLC-MS／MS 法同時測定感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，該方法快速高效，靈敏度高，重復性好，可為完善該制劑質(zhì)量標準提供參考。