青藤堿對膽管癌細胞的抑制作用

呂彥霖鄧亞竹朱昌毫崔勝男喻超孫誠誼

（貴州醫科大學，貴州 貴陽550004）

膽管癌是屬于原發性肝癌的一種常見惡性腫瘤，我國惡性腫瘤的發病率和死亡率一直穩中有升［1］，其患病初期難以診斷，大多數患者確診時已為晚期［2-3］。盡管膽管癌的臨床診療方法日新月異，但對晚期患者尚無有效控制病情發生發展的手段，導致總體預后較差，5 年生存率僅20%～30%［4］。因此，尋找一種新型、高效、低毒的藥物以改善現有膽管癌臨床診療方案變得極為迫切。

有研究發現，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中的表達較癌旁組織及正常膽管組織更高，提示該通路可能參與病情發生發展，并可作為其生物學行為的評估指標［5-6］。PI3K 是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，國內外研究認為PI3K／Akt 是一種與細胞增殖、凋亡密切相關的信號通路，在膽管癌治療中發揮重要作用［7］。

許多中藥提取物在多種癌癥治療中均表現出優秀的抗腫瘤作用［8-10］，而且有著價格低廉、儲量豐富等優點。青藤堿是從青藤中提取的一種活性物質，研究人員發現該成分可直接或間接地在視網膜母細胞瘤［11］、乳腺癌［12］、胃癌［13］、腎細胞癌［14］等多種腫瘤中發揮抗癌作用，而且與PI3K／Akt 信號通路及相關蛋白表達密切相關。課題組前期研究發現，青藤堿可在體外有效抑制膽管癌細胞增殖，促進膽管癌細胞凋亡［15］。因此，本實驗從PI3K／Akt 通路著手，考察該成分對膽管癌的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞 HuCCT-1、TFK-1 膽管癌細胞株，由武漢同濟醫院肝膽胰外科肝膽胰外科實驗室提供。

1.2 動物 6 周齡SPF 級雌性免疫缺陷BALB／c nude mice 裸鼠18只，體質量約為20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0008，按照SPF 級標準飼養于貴州醫科大學臨床研究中心動物房，溫度（25±2）℃，相對濕度70%，晝夜12 h／12 h，自由飲食飲水。所有動物操作實驗均按貴州醫科大學動物保護和利用委員會批準的規程進行。

1.3 試劑與藥物 青藤堿（批號S235901，純度99.88%）、LY294002（批號S110504，純度99.84%）均購自美國Selleck 公司。胎牛血清、RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶、0.05% 不含EDTA 的胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；GeenNucTM活細胞caspase-3 活性檢測試劑盒［含GreenNucTMcaspase-3 Substrate與Ac-DEVD-CHO（乙酰基-天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨醛）］（南京碧云天生物技術有限公司）；AV-FITC／PI 凋亡試劑盒（美國BD 公司）；RIPA裂解緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（美國Millipore 公司）；cleaved caspase-3、PCNA、PI3K、p-Akt、Akt 抗體（美國CST 公司）；Ki67抗體（上海愛必信生物科技有限公司）；羊抗鼠、羊抗兔抗體（美國Boster Bio 公司）。

2 方法

2.1 GreenNucTM活細胞caspase-3 活性檢測 取對數生長期細胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用含10%血清的培養基終止消化后，得到細胞懸液。細胞計數后，以每孔4×103個的密度接種于96 孔板，待細胞貼壁后分為3組，分別為0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿＋Ac-DEVD-CHO 抑制劑（20 μmol／L）組，重復3次，各孔加入相應試劑后放入培養箱孵育24 h，用含5 μmol／L GreenNucTMcaspase-3 Substrate 底物的RPIM-1640 培養液進行換液，Ac-DEVD-CHO 抑制劑組補充20 μmol／L 抑制劑。將96 孔板在室溫下避光孵育30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，設置綠色熒光的濾光片最大激發波長為500 nm／530 nm，拍照并記錄結果，設置酶標儀激發波長／發射波長為485 nm／515 nm，采用酶標儀檢測，并記錄結果。

2.2 Annexin V／PI 雙染色檢測細胞凋亡率 取對數期生長膽管癌細胞，以每孔5×104個的密度接種6 孔板中，置于培養箱中培養，待細胞貼壁后分為2組，分別為0 μL LY294002 組、5 μL LY294002（caspase-3 抑制劑）組，繼續培養24 h 后收集各組細胞，將6 孔板內上清液收集于15 mL 離心管中，PBS 清洗，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化細胞，用含血清培養基終止消化，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，加入PBS 至15 mL 離心管中，轉移細胞懸液于流式管內，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，每管加入500 μL 1×Binding buffer、5×105個細胞，再加入5 μL AnnexinV FITC 染色液、10 μL PI染色液，輕輕吹打均勻，在4 ℃下避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.3 Western blot 檢測細胞增殖、凋亡及PI3K／Akt信號通路相關蛋白表達 取對數期生長膽管癌細胞，以每孔5×105個的密度接種于6 孔板中，待其貼壁后進行分組和加藥，24 h 后收集細胞，采用RIPA 裂解液，在4 ℃下提取細胞總蛋白采用，BCA 蛋白法檢測蛋白濃度，與5×Loading buffer 混合后在95 ℃下煮沸10 min，每孔泳道中加入20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳（90 V、2 h），再300 mA 恒流2 h 轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次15 min，最后使用ECL發光液曝光顯色，通過ImageJ 1.45s 軟件進行灰度值分析。

2.4 裸鼠皮下成瘤實驗 取對數期生長膽管癌Hucct-1 細胞，調整密度為4×106／200 μL，置于冰盒中待用，碘伏、酒精消毒裸鼠皮膚，胰島素針將200 μL 細胞懸液緩慢注射入裸鼠右腋下，形成3～5 mm 的皮丘。Hucct-1 細胞植入24 h后，裸鼠隨機分為生理鹽水組及青藤堿低、高劑量組（75、150 mg／kg），生理鹽水組腹腔注射生理鹽水，青藤堿組腹腔注射PBS 溶解的青藤堿混懸液，每只100 μL，每天1次，每周觀察腫瘤生長情況及生命體征，稱定體質量，游標卡尺測量腫瘤大小并計算其體積。給藥4 周后，乙醚麻醉處死裸鼠，測定腫瘤質量，組織提取蛋白，按“2.3”項下方法進行Western blot 實驗。

2.5 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 青藤堿抑制膽管癌細胞增殖 如圖1 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著該成分濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細胞中增殖關鍵蛋白Ki67、PCNA表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中Ki67、PCNA 蛋白表達的影響（， n＝3）Fig.1 Effects of sinomenine on protein expressions of Ki67 and PCNA in Hucct-1 and TFK-1cells（， n＝3）

3.2 青藤堿促進膽管癌細胞凋亡 如圖2 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，1.0 mmol／L 青藤堿干預后Hucct-1、TFK-1 細胞核可見綠色熒光（凋亡細胞），細胞caspase-3 活性升高（P＜0.01）。

圖2 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中caspase-3 活性的影響（， n＝3）Fig.2 Effects of sinomenine on caspase-3 activities in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

3.3 PI3K／Akt 信號通路參與青藤堿誘導凋亡的過程 如圖3 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著青藤堿濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt、PI3K 蛋白表達均降低（P＜0.01）。如圖4 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 干預后能降低Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt 蛋白比值和增殖關鍵蛋白Ki67 表達，增加凋亡關鍵蛋白cleaved caspase-3 表達（P＜0.05，P＜0.01）。如圖5 所示，與單用1 mmol／L 青藤堿比較，5 μL LY294002＋1 mmol／L 青藤堿干預后可進一步降低Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt、Ki67 蛋白表達，增加cleaved caspase-3 蛋白表達（P＜0.01）。如圖6 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 可促進Hucct-1、TFK-1 細胞的凋亡（P＜0.01）；與單用青藤堿比較，5 μL LY294002 ＋1 mmol／L青藤堿可促進Hucct-1、TFK-1 細胞凋亡（P＜0.01），而且效果優于單用LY294002（P＜0.01）。

圖3 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中PI3K／Akt 通路的抑制作用（， n＝3）Fig.3 Inhibitory effects of sinomenine on PI3K／Akt pathway in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖4 LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞中增殖與凋亡關鍵蛋白的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖5 青藤堿聯合LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞中關鍵蛋白增殖與凋亡的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖6 青藤堿聯合LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the apoptosis of Hucct-1 and TFK-1 cells

3.4 青藤堿在體內抑制膽管癌荷瘤生長 如圖7所示，給藥4 周內各組裸鼠體質量均無明顯變化（P＞0.05）。如圖8 所示，與生理鹽水組比較，給藥2 周后青藤堿高劑量組對腫瘤生長有較強的抑制作用（P＜0.05），給藥4 周后各劑量組均表現出不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。如圖9所示，與生理鹽水組比較，青藤堿各劑量組裸鼠荷瘤組織細胞中Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達隨劑量增加而降低（P＜0.01），cleaved caspase-3 蛋白表達隨著劑量增加而升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 各組裸鼠體質量變化（， n＝6）Fig.7 Body weight changes of nude mice in each group（， n＝6）

圖8 各組裸鼠腫瘤體積、質量變化（， n＝6）Fig.8 Changes of tumor volumes and weights of nude mice in each group（， n＝6）

圖9 各組裸鼠腫瘤組織中關鍵蛋白表達（， n＝6）Fig.9 Expressions of key proteins in tumor tissues of nude mice in each group（， n＝6）

4 討論

膽管癌是一種高發病率和高死亡率的肝膽腫瘤，其起病初期隱蔽，診斷困難，雖然相關治療取得了很大進展，但5 年生存率仍不理想［16-17］。目前，臨床上許多抗腫瘤藥物都存在免疫抑制、副作用大、價格昂貴、效果有限等問題，故尋找一種新型、廉價、低毒的藥物來提高患者的生活質量是非常迫切的。

青藤堿是從青藤中提取的活性成分，可在體外對膽管癌發揮優秀的抑制作用［15］，但其分子機制尚不清楚。有研究發現，與癌旁膽管癌組織與正常膽管組織比較，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中異常激活，表現出高表達水平［5-6］，提示其異常激活可能對促進膽管癌細胞增殖起到積極的促進作用，抑制此通路可起到良好的抗膽管癌作用。大量報道顯示，青藤堿抗癌作用與PI3K／Akt 通路密切相關［11，14］。本實驗發現，青藤堿可顯著抑制膽管癌細胞中PI3K／Akt 信號通路和細胞株增殖，并誘導其凋亡。

前期發現，腹腔注射75 mg／kg 青藤堿可在裸鼠體內發揮優異的抗食管鱗狀細胞癌作用［18］；在150 mg／kg劑量下，可顯著改善小鼠乳腺癌細胞對骨的破壞［19］；在75、150 mg／kg 劑量下，可較好地抑制人乳腺癌腫瘤的生長［20］。因此，本實驗采用裸鼠建立皮下成瘤模型，每天腹腔注射給藥，發現相較于模型組，青藤堿治療組小鼠體質量并無明顯變化，但隨著其給藥劑量增加，對腫瘤生長的抑制作用增強，并且cleaved caspase-3 蛋白表達升高，Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達降低。

綜上所述，青藤堿可通過PI3K／Akt 途徑有效抑制膽管癌細胞增殖，并誘導其凋亡，具有明顯的抗膽管癌作用，可為臨床相關治療提供新視角，但該成分正式應用于臨床還需作進一步探索。