甜菊素對RANKL 誘導的破骨細胞分化和功能的影響

陳莎周佳瑛儲非凡林芝張偉琪朱愛芳*

（1.紹興市柯橋區婦幼保健院，浙江 紹興312030； 2.溫州醫科大學第二臨床醫學院，浙江 溫州325035；3.溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江 溫州325035）

骨質疏松是一種以單位體積內骨量減少為特點的代謝性骨病變，多發于中老年人，絕經后女性發病率高于男性［1］。雖然死亡率不及心腦血管疾病和惡性腫瘤，但是其并發癥骨折所造成的高致殘率嚴重影響患者身心健康［2-3］。目前已有的藥物如雙膦酸鹽類［4］、維生素D類［5］均不能達到理想的治療效果；雌激素類藥物具有較大副作用［6］。因此，迫切需要尋找到一種安全、高效的治療骨質疏松的新藥物。

天然中藥單體憑借其活性強、副作用小等優點，有望成為多種疾病的潛在治療藥物［7］。甜菊素提取自多年生草本植物甜葉菊，已有研究報道其能夠抑制NF-κB 通路，起到抗炎、抗氧化作用［8］。因此，本實驗將探究甜菊素是否能夠通過減輕NFκB 介導的炎癥和氧化應激反應，從而抑制破骨細胞的分化和功能。

中藥結構較復雜，隨著網絡藥理學和分子對接技術的興起與成熟，能較好地深入探究其分子層面的作用機制。因此，本研究將結合網絡藥理學靶點預測、分子對接和Western blot 技術尋找出甜菊素的作用靶點，并通過體外實驗驗證甜菊素對靶點及其下游信號通路作用，以期構建一條“甜菊素-靶點-下游通路”作用邏輯鏈。

1 材料

1.1 動物 10 周齡C57BL／6 小鼠，體質量（20±2）g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0004。

1.2 試劑與藥物 甜菊素（純度98%，CAS 號57817-89-7）對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。CCK-8 試劑盒（貨號CA1210-500T）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色液（貨號G1492-4）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠RANK 配體（RANKL）（貨號R0525）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）（貨號SRP3221）購自美國Sigma-Aldrich公 司；CTSK（貨 號 ab207086）、c-Fos（貨 號ab222699）、IκB-α（貨號ab32518）特異性抗體購自英國Abcam 公司；AKR1B1（貨號67498-1-Ig）特異性抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；TRIzol（貨號15596018）購自美國Thermo Fisher Scientifie 公司；Acp5、V-ATpase-d2、CTSK、c-Fos、NFATc-1 特異性PCR 引物、SYBR Green（貨號A25742）購自美國Thermo Fisher Scientifie 公司。

1.3 儀器 SW-CJ-2F／2FD 雙人凈化工作臺（廣州萬邦凈化設備有限公司）；Thermo 8000 系列水套式3429 CO2細胞培養箱、Sorvall ST40R 高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientifie 公司）；尼康E200 生物顯微鏡酶標儀（日本尼康公司）；K3 plus 酶標儀（北京優健萌威醫藥科技有限公司）；GelDoc XR＋凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 骨髓單核巨噬細胞（BMMs）提取與培養小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒后移入超凈臺，用經過高壓蒸汽滅菌的鑷子、剪刀取下四肢，剔除皮毛和肌肉組織，分離出完整的股骨和脛骨，置于含10%胎牛血清的α-MEM 培養基中，切開長骨兩端，用5 mL 注射器吸取大皿中的培養基，對準切口沖出長骨內的骨髓，直至長骨由暗紅色變為通透的白色，1 000 μL 移液槍將骨髓吹打混勻，40 μm過濾器過濾，濾液1 500 r／min 離心5 min，棄上清，加入α-MEM 完全培養基（10% 胎牛血清、0.5%雙抗）重懸，接種至T75 培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養過夜，待細胞貼壁后隔天換液，直至細胞密度達90%后進行細胞傳代，取1～3 代用于實驗。

2.2 CCK-8 檢測BMMs 細胞存活率 將原代BMMs 細胞以每孔5×103個細胞密度接種至96 孔板中，每孔加入100 μL 含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養基（含10% 胎牛血清、1% 雙抗），置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養過夜，待細胞貼壁后更換相同培養基，分別加入5、10、20、40 μmol／L溶解于無菌PBS 的甜菊素，每組3 個復孔，置于恒溫箱中繼續培養5 d，隔天換液并補充對應濃度的甜菊素，5 d 后在每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，繼續在培養箱中孵育2 h 后取出，采用多功能酶標儀，在450 nm 波長處檢測光密度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 TRAP 染色檢測破骨細胞形成 將原代BMMs細胞以每孔5×103個的密度接種至96 孔板中，每孔加入100 μL 含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養基，待細胞貼壁后分為對照組、RANKL 組、甜菊素組，RANKL 組給予50 ng／mL RANKL 刺激，甜菊素組在RANKL 刺激的基礎上分別給予5、10 μmol／L該成分，隔天更換培養基并補充兩者，培養5～7 d 至RANKL 組出現破骨細胞后移除培養基，2.5%戊二醛固定15 min，無菌PBS 清洗3次，加入TRAP 染液，置于37 ℃恒溫箱中孵育3 h，染色完成后用無菌PBS 洗去多余染液，在顯微鏡下觀察拍照，以細胞核≥3 個的細胞為破骨細胞，統計其數量。

2.4 甜菊素預測靶點的獲取及分子對接驗證 從PubChem 數據庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）中獲取甜菊素結構式的sdf 文件，上傳到 PharmMappper 數據庫（http：／ ／www.lilabecust.cn／pharmmapper／）［9］以預測甜菊素的潛在目標，設置PharmMappper 參數，Generate Conformers為Yes；Maximum Generated Conformations 為300；Select Target Set 為Human Protein Target Only，為了提高預測準確性，選取預測結果中NormFit ＞0.9的靶 點。再 從PDB 數據庫（http：／ ／www.rcsb.org／）［10］中下載篩選出的預測靶點的蛋白構象的pdb 文件，為了確保對接結果有更高可信度，選用來源于人或者小鼠。最后采用LibDock 對甜菊素和預測靶點進行模擬對接評分，得分＞100 視為對接成功［11］。

2.5 RT-qPCR 檢測破骨細胞溶骨相關基因和調節分化相關轉錄因子表達 將原代BMMs 細胞以每孔8×104個的密度接種至6 孔板中，每孔加入2 mL含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養基，待細胞貼壁后分為對照組、RANKL 組、甜菊素組，RANKL 組給予50 ng／mL RANKL 刺激，甜菊素組在RANKL 刺激的基礎上給予10 μmol／L 該成分，隔天更換培養基并補充兩者，培養5 d 后移除培養基，每孔加入600 μL TRIzol，置于冰上靜置裂解5 min，吸取混合液至1.5 mL EP 管中，加入150 μL氯仿，振蕩15 s 后靜置5 min，4 ℃、12 000 r／min離心15 min 后取上清，加入500 μL 異丙醇，靜置10 min，4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，棄去上清，75%乙醇清洗1次，即得總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，實時熒光定量PCR 儀檢測破骨細胞溶骨相關基因（Acp5，V-ATpase-d2，CTSK）和調節分化相關轉錄因子（c-Fos， NFATc-1）相對表達，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 熒光素報告酶分析 將構建有NF-κB 熒光素酶基因的RAW264.7 細胞接種于96 孔板中，調整細胞密度為每孔5×103個，加入100 μL 含50 ng／mL MCSF 的α-MEM 完全培養基，細胞貼壁后按“2.5”項下方法分組及給藥，置于培養箱中繼續培養6 h，采用熒光素報告酶試劑盒和多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

2.7 Western blot 檢測c-Fos、CTSK、IκBα、AKR1B1蛋白表達 BMMs 細胞按“2.5”項下方法分組及給藥，采用細胞總蛋白提取試劑裂解細胞提取蛋白，SDS-PAGE 電泳分離目標蛋白后轉移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶，在4 ℃下封閉過夜，棄去封閉液，洗膜3次，每次15 min，加入一抗，在4 ℃下孵育12 h，洗膜3次，每次15 min，加入二抗，常溫孵育2 h，在凝膠成像系統下顯影，Image Lab 軟件對所得條帶灰度值進行分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.8 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用Student’st檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 甜菊素對BMMs 細胞活性的影響 如圖1 所示，與對照組（0 μmol／L）比較，各濃度甜菊素OD值無明顯變化（P＞0.05），表明該成分濃度在0～40 μmol／L 范圍內對BMMs 細胞無毒性。

圖1 甜菊素對BMMs 細胞活性的影響（， n＝3）Fig.1 Effect of steviosin on BMMs cell viability（， n＝3）

3.2 甜菊素抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化 如圖2 所示，與對照組比較，RANKL 組BMMs 細胞分化融合為多核破骨細胞；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細胞數量呈劑量依賴性減少（P＜0.01），即10 μmol／L 時效果最強。

圖2 甜菊素抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化Fig.2 Inhibitory effect of steviosin on differentiation of RANKL-induced osteoclasts

3.3 甜菊素與AKR1B1 的分子對接 共預測得到290 個甜菊素的潛在作用靶點，其中NormFit＞0.9的靶點共有26 個。經LibDock 分子對接后，共有5個靶點與甜菊素對接成功，其中AKR1B1 以200.062 的得分位居第一，見圖3、表2。

表2 甜菊素與預測靶點的LibDock 對接評分Tab.2 LibDock docking scores for steviosin and predicted targets

圖3 甜菊素與AKR1B1 的分子對接Fig.3 Molecular docking for steviosin and AKR1B1

3.4 甜菊素抑制RANKL 誘導的破骨細胞中AKR1B1 的表達 如圖4 所示，與對照組比較，RANKL 組破骨細胞中AKR1B1 表達升高（P＜0.05）；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細胞中AKR1B1 表達降低（P＜0.05）。

圖4 甜菊素抑制破骨細胞中AKR1B1 表達（，n＝3）Fig.4 Inhibitory effect of steviosin on AKR1B1 expressions in osteoclasts（， n＝3）

3.5 甜菊素抑制破骨細胞溶骨相關基因和調節分化相關轉錄因子的表達 如圖5 所示，與對照組比較，RANKL 組破骨細胞溶骨相關基因Acp5、VATpase-d2、CTSK以及調節分化相關轉錄因子c-Fos、Naftc-1 mRNA 表達均升高（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細胞中上述基因表達均降低（P＜0.01）。

圖5 各組破骨細胞Acp5、 V-ATpase-d2、 CTSK、 c-Fos、 Naftc-1 mRNA 表達（， n＝3）Fig.5 mRNA expressions of Acp5， V-ATpase-d2，CTSK， c-Fos and Naftc-1 of osteoclasts in each group（， n＝3）

3.6 甜菊素對c-Fos 通路的抑制作用 如圖6 所示，與RANKL 組比較，甜菊素組c-Fos、CTSK 蛋白表達均降低（P＜0.01）。

圖6 甜菊素抑制c-Fos 通路激活（， n＝3）Fig.6 Inhibitory effect of steviosin on c-Fos pathway activation（， n＝3）

3.7 甜菊素對NF-κB 通路的抑制作用 如圖7A所示，與對照組比較，RANKL 組NF-κB 的熒光素酶活性增強（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組NF-κB 的熒光素酶活性減弱（P＜0.01）。如圖7B～7C 所示，與對照組比較，RANKL 組NF-κB通路激活中關鍵的負調節蛋白IκBα 的表達降低（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組IκBα 蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖7 甜菊素抑制NF-κB 通路活化（， n＝3）Fig.7 Inhibitory effect of steviosin on NF-κB pathway activation（， n＝3）

4 討論

甜菊素是一種天然來源的雙萜配糖體，也作為甜味劑使用，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤［12］等多種生物活性，本研究探討甜菊素通過抑制破骨細胞活性從而達到治療骨質疏松的作用。

破骨細胞的活性主要體現在能否從BMMs 細胞分化成破骨細胞，以及其溶骨功能的強弱［6］。破骨細胞的骨溶解功能主要由CTSK 行使［13］，Acp5則能增強CTSK 的功能。本研究顯示甜菊素降低了RANKL 誘導的破骨細胞中CTSK和Acp5 的表達，提示甜菊素對破骨細胞溶骨功能具有抑制作用。V-ATpase-d 能夠促進破骨細胞分化，已有研究證明抑制V-ATpase-d2 阻止了前體細胞融合形成破骨細胞［14］。NFATc-1 是有關破骨細胞分化和功能行使關鍵轉錄因子，c-Fos 是激活蛋白-1（AP-1）的重要組成部分［15］，兩者均能夠促進下游CTSK、Acp5 和V-ATpase-d2 的表達，抑制NFATc-1 和c-Fos 表達便能抑制下游效應蛋白的表達，從而很大程度上地抑制破骨細胞的活性，本研究結果證實這一點。

除了NFATc-1、c-Fos、NF-κB 在RANKL 誘導的破骨細胞分化中也扮演重要的角色［16-17］，RANKL 和RANK 結合，通過膜受體TRAF6 激活核因子κB 激酶抑制劑（IKK），活化的IKK 進而降解IκBα［18］，從而釋放NF-κB，NF-κB 轉位進入細胞核［19］，促進了NFATc-1 和c-Fos，進而通過一系列級聯反應誘導破骨細胞的分化。IκBα 作為這條通路中的關鍵蛋白，其表達與NF-κB 通路的活性呈負相關。本研究結果顯示，甜菊素能上調破骨細胞中IκBα 表達，表明甜菊素也能夠通過抑制NFκB 途徑來發揮抑制破骨細胞分化的作用。

AKR1B1 是一種NADPH 依賴性酶，催化各種醛和酮還原為相應的醇［20］，具有較好的抗氧化作用，有研究顯示其能夠激活p65 從而活化NF-κB信號通路［21-22］。根據LibDock 對甜菊素和AKR1B1對接的高評分，預測甜菊素可能通過AKR1B1 調控NF-κB 信號通路的活性。

綜上所述，甜菊素可能通過抑制AKR1B1／NFκB軸，進而減少轉錄因子NFATc-1 和c-Fos 表達，最終起到抑制破骨細胞分化和功能的作用。本課題組后續將會對甜菊素深層機制及其在體內的作用進一步研究，為將來開發安全、高效的治療骨質疏松的藥物提供基礎。