俄色葉HPLC 指紋圖譜建立及7 種成分測定

徐俊陳華林陳蓉康晉梅李敏

（成都中醫(yī)藥大學，中藥材標準化教育部重點實驗室，省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川成都611137）

俄色葉為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malus toringoide（Rehd.）Hughes.或花葉海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥葉及葉芽［1］，在《四部醫(yī)典》［2］、《晶珠本草》［3］、《藏藥晶鏡本草》［4］中均有記載，具有攻堅化積、除膩滌滯、保肝利膽的功效，它已被開發(fā)的雪域俄色茶［5-9］、功能性食品［10-11］、保肝藥物［12-13］、俄色黃酮分子膠囊［14］、俄色-A 毛囊靶向脂質(zhì)體［15］、俄色總黃酮緩釋栓劑與片劑［16-17］、俄色黃酮微囊［18］、俄色黃酮-β-環(huán)糊精包合物［19］、復方顆粒劑［20-21］等，在藥用、食用方面均具有重要價值。另外，該屬植物包括多種海棠，在性狀、成分方面存在相似性［22］。

目前，俄色葉質(zhì)量標準僅以根皮素為含量測定指標，不能有效地控制其質(zhì)量［23］。因此，建立俄色葉HPLC 指紋圖譜，并同時測定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素的含量，以期為完善該藥材質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（德國默克密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號wkq16052705）、金絲桃苷（批號wkq16050305）、異槲皮苷（批號wkq16050607）、槲皮苷（批號wkq17113002）、根皮 苷（批 號 wkq17122002）、槲皮素（批 號wkq17072005）、根皮素（批號wkq17081715）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98 %。乙腈、甲醇為色譜純；磷酸等其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 藥材 俄色葉共13 批（編號S1～S13），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學李敏教授鑒定為薔薇科植物變?nèi)~海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes.或花葉海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥葉或葉芽，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Insertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～12% A；10～15 min，12%～15% A；15～16 min，15%～18% A；16～60 min，18% A；60～65 min，18%～22% A；65～70 min，22%～25%A；70～80 min，25%～30%A；80～85 min，30%～40%A；85～92 min，40%A；92～100 min，40%～52%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長340 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品綠原酸、槲皮素各1 mg，金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷各2 mg，根皮苷10 mg，根皮素5 mg，置于25 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取藥材細粉（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL75% 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，75% 甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液（S2），在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.12%～2.06%，相對保留時間RSD 為0.02%～0.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗 取同一批樣品（S2），按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.07%～2.42%，相對保留時間RSD 為0.03%～0.23%，表明方法重復性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.28%～2.71%，相對保留時間RSD 為0.01%～0.57%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 圖譜生成 取13 批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，將相關數(shù)據(jù)導入“色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012A版，采用共有模式圖譜生成對照指紋圖譜（R）［24］。同時取對照品溶液適量，對其中7 個色譜峰進行指認定性，見圖1～2。由此可知，13 批樣品HPLC 指紋圖譜中有17 個共有峰，指認出其中7個，即5 號峰為綠原酸，8 號峰為金絲桃苷，9 號峰為異槲皮苷，11號峰為槲皮苷，12 號峰為根皮苷，13 號峰為槲皮素，14 號峰為根皮素。再采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版，以共有模式圖譜（R）為參照，發(fā)現(xiàn)其相似度良好，為0.948～0.993。

圖1 13 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for thirteen batches of samples

圖2 各成分HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅰ）

2.2 聚類分析 以7 個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0 軟件中的組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進行聚類分析，結(jié)果見圖3。由此可知，13 批樣品可聚為3類，S1、S3、S5、S7、S8 為第1類，S10、S11、S12、S13 為第2類，S2、S4、S6、S9為第3 類。

圖3 13 批樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram for thirteen batches of samples

2.3 7 種成分含量測定

2.3.1 色譜條件 Insertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，12%～15% A；5～15 min，15%～20% A；15～28 min，20% A；28～48 min，20%～42% A；48～50 min，42%～50% A；50～55 min，50%～12% A）；體積流量0.7 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長340 nm；進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于不同25 mL 量瓶中，75%甲醇溶解并定容，制得貯備液，分別取適量至同一10 mL 量瓶中，75%甲醇稀釋，即得（綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.125、0.35、0.86、0.38、9.3、0.01、0.85 mg／mL）。

2.3.3 供試品溶液制備 同“2.1.3”項。

2.3.4 系統(tǒng)適應性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖4。由此可知，各成分分離度和理論塔板數(shù)良好，陰性無干擾。

圖4 各成分HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.5 方法學考察

2.3.5.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液4 000、2 000、1 000、600、250 μL，置于不同10 mL量瓶中，75% 甲醇制成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，見表2。由此可知，各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，每次10 μL，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為1.63%、0.12%、0.22%、0.57%、0.21%、0.94%、0.85%，表明儀器精密度良好。

2.3.5.3 重復性試驗 精密稱取藥材粉末（S6）6份，每份0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下各進樣10 μL測定，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為0.98%、1.15%、0.96%、1.40%、0.85%、1.34%、1.86%，表明該方法重復性良好。

2.3.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（S6），室溫下于 0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為0.63%、0.38%、0.54%、1.92%、0.51%、1.77%、0.60%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末（S6）6份，每份0.25 g，按100%水平加入對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素平均加樣回收率分別為96.4%、99.5%、99.8%、100.1%、99.9%、99.0%、99.9%，RSD 分別為 1.3%、1.0%、0.7%、0.8%、0.4%、2.9%、0.7%。

2.3.5.6 樣品含量測定 結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3 討論

本實驗考察不同流動相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、檢測波長（256、286、330、340、345、350、355、360 nm），結(jié)合分離度、色譜峰數(shù)目和峰形、基線平穩(wěn)程度，最終分別確定為乙腈-0.1%磷酸、340 nm。再考察不同提取方法（超聲、加熱回流）、提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇）、超聲時間（30、45、60 min），最終確定為75%甲醇超聲提取45 min。

聚類分析結(jié)果顯示，13 批俄色葉聚為3類，與該藥材來源和藥用部位存在一定相關性，其中葉芽中各成分總含量高于葉中。另外，S8 與S2、S4、S9 的相似度較低，表明不同基原俄色葉在成分含量上可能存在一定差異。

俄色葉中異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、根皮素含量較高，而綠原酸、金絲桃苷、槲皮素較低。上述7 種成分均具有保肝、抗氧化、保護心血管等藥理活性［25-30］，可為全面評價俄色葉質(zhì)量提供參考。