鹿角與鹿茸蛋白質鑒定

楊歡Roselyn Tehzee Gblinwon楊婭婭王強陳香盧夢瑤鄭晗雪吳沅臻夏國華*沈玉萍

（1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江212013； 2.鎮江市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鎮江212050）

鹿角Cervi Cornu為鹿科動物馬鹿或梅花鹿已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基，鹿茸Cervi Cornu Pantotrichum為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是我國特有的貴細動物藥，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效［1］，兩者經炮制為飲片后入藥，包括鹿角片、鹿角粉、鹿茸片、鹿茸粉。鹿角質量控制依據浸出物含量，而鹿茸質量控制主要采用顯色反應和薄層色譜法，均缺乏特異性，給鹿角與鹿茸的真偽鑒別帶來困難［2-5］。

動物藥中蛋白質含量較高且種類豐富，同一基原動物的不同藥用部位中標志蛋白質的種類有別，特異性較高。SDS-PAGE 和2-DE 是分析蛋白質的兩種重要方法，在中藥質量評價等研究領域中已被廣泛應用［6-10］。邱乙等［11］基于差異蛋白質建立了SDS-PAGE 鑒別僵蠶及其常見偽品的技術，并利用2-DE 尋找到冬蟲夏草特有的26 種指標性蛋白質；Baskova等［12］用2-DE 區分3 種水蛭唾液腺分泌物的蛋白質和多肽組成。此外，將蛋白質酶解所得多肽混合物進行軟電離，結合生物信息學分析可進行蛋白質的鑒定［13］。Lin等［14］結合SDS-PAGE、2-DE、MALDI-TOF／TOF-MS 分析，從僵蠶中鑒別出32 種蛋白質。

因此，本實驗采用SDS-PAGE 和2-DE 分析鹿角與鹿茸的蛋白質組成及其差異，將蛋白質條帶進行胰蛋白酶膠內消化，通過MALDI-TOF／TOF-MS分析獲取多肽的質譜圖，通過MASCOT 檢索鑒定蛋白質，為鹿角與鹿茸的鑒別提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 AE240 電子分析天平（0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）；T-MS 型恒溫混勻儀（寧波拓普森科學儀器有限公司）；1-13 型臺式高速離心機（美國Sigma 公司）；TGL-16M 型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器有限公司）；XHF-DY 型高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；SpectraMax Gemini EM 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；Ettan IPGphor 3 型等電聚焦儀（美國GE Healthcare 公司）；Autoflex 型MALDI-TOF／TOF-MS（美國Bruker Daltonics 公司）；臺式快速離心濃縮干燥器（美國Labconco 公司）；Alpha 1-2 LD plus型凍干機（德國Christ 公司）。

1.2 試劑 Biosharp 透析袋（蘭杰柯科技有限公司）；蛋白分子量標準（14.4～116 kD）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。雙叉丙烯酰胺、丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、碳酸氫銨（上海生工生物工程股份有限公司）；Destreak Rehydration Reagent（美 國 GE Healthcare 公司）；IPG Strips、Bio-Lyte 3-10 Buffer（美國Bio-Rad 公司）；二硫蘇糖醇、碘代乙酰胺（分析純，美國Sigma-Aldrich 公司）；乙腈、三氟乙酸（色譜純，美國Omni 公司）；modified trypsin（美國Promega 公司）；α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（美國Sigma-Aldrich 公司）；甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（Smartplus-P 水純化系統，上?？道追治鰞x器有限公司）。

1.3 藥材 鹿角片、鹿茸片各9批，均由亳州市佰世信中藥飲片有限公司提供，產地吉林，分別來源于鹿科動物馬鹿Cervi elaphus已骨化的角或角基、馬鹿Cervi elaphus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，經鎮江市中醫院藥劑科孫小祥主任中藥師鑒定為正品，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 SDS-PAGE 分析

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取鹿角粉末（40目以下）100 mg，置于50 mL 離心管中，加入蛋白質裂解液2.0 mL，室溫、8 000 r／min 高速勻漿10 min，勻漿液12 000 r／min 離心5 min，吸出上清液，即得鹿角蛋白質供試品溶液；另精密稱取100 mg 鹿茸粉末（40 目以下），置于2.0 mL 離心管中，加入蛋白質裂解液0.4 mL，混勻后超聲提取30 mins，混懸液12 000 r／min 離心5 min，吸出上清液，即得鹿茸蛋白質供試品溶液，在4 ℃下保存。

2.1.2 分析條件 制備SDS-PAGE 凝膠（5%集成膠，12%分離膠），分別吸取“2.1.1”項下供試品溶液各15 μL、蛋白質混合對照品溶液5 μL，載入凝膠泳道。濃縮膠電壓設定為80 V，當溴酚藍指示劑到達分離膠時，上調電壓至110 V 繼續電泳約50 min，取出凝膠，采用考馬斯亮藍染色法進行染色。

2.2 2-DE 分析

2.2.1 供試品溶液制備 分別精密稱取鹿角、鹿茸粉末各2.00 g，加入5.0 mL 蛋白質裂解液，按“2.1.1”項下方法提取2次，合并上清液，超純水透析，內容物凍干后在-70 ℃下低溫冷凍保存。臨用前，加入200 μL 水化液復溶，并使用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。

2.2.2 蛋白質水化與等電聚焦 將供試品溶液中蛋白質質量濃度調整為3.5 mg／mL，分別吸取350 μL，再加入1.75 μL IPG 緩沖液（pH3～10），混勻，高速離心15 min，移取上清液至陶瓷槽中，使IPG 膠條充分接觸蛋白溶液，再加入3 mL 礦物油覆蓋在膠條上，逐步升高電壓至8 kV 進行等電聚焦。

2.2.3 IPG 膠條平衡與SDS-PAGE 電泳 IEF 結束后取出IPG 膠條，超純水洗凈，將膠條放入5 mL平衡液（含0.05 g DTT、0.625 g 碘代乙酰胺）中，振搖15 min 平衡，重復2次，取出膠條，置于12%凝膠上，依次采用5、15 W 進行電泳分離，取出凝膠，采用考馬斯亮藍染色法進行染色。

2.3 蛋白質鑒定 切取鹿角與鹿茸目的蛋白質條帶，置于離心管中切成小塊，加入超純水洗滌2次，加入50%乙腈-0.1%TFA 200 μL 洗滌2次，再加入100 μL 乙腈洗滌，離心濃縮儀除去殘留溶劑，加入10.0 mmol／L DTT-25.0 mmol／L NH4HCO3溶液60 μL，在37 ℃下孵育1 h，冷卻至室溫，棄去溶液，再加入 55.0 mmol／L IAM-25.0 mmol／L NH4HCO360 μL，渦旋混勻，室溫避光放置45 min，棄去溶液，25.0 mmol／L NH4HCO3、50%乙腈、乙腈各100 μL 依次洗滌，揮干溶劑，膠條中加入10 ng／μL 胰蛋白酶溶液15 μL，室溫放置30 min，再加入 50.0 mmol／L NH4HCO3-乙 腈20 μL，混勻后在37 ℃下孵育過夜，自然冷卻至室溫后加入超純水200 μL，混勻，離心1 min，吸出上清液，膠條碎片中再加入50% 乙腈-5% TFA 50 μL提取30 min，離心1 min，吸出上清液，再提取2次，合并上清液，離心濃縮儀除去溶劑，在上述多肽片段混合物中加入80% 乙腈-0.1% TFA 20 μL復溶，吸取0.5 μL 供試品溶液點樣 于MALDI 分析板，并加入α-CHCA 基質溶液0.5 μL迅速混勻，室溫干燥后采用MALDI-TOF／TOF-MS分析。陽離子模式，線性；掃描次數500；激光頻率1 000 Hz；離子源1 電壓25.01 kV；離子源2 電壓22.51 kV；透鏡電壓7.29 kV；脈沖離子提取時間150 ns；基質抑制偏離；抑制值600 Da；質量范圍1 000～5 000 Da，所得質譜數據采用MASCOT進行分析。

3 結果

3.1 SDS-PAGE 圖1～2 顯示，鹿角與鹿茸在14.4～116 kD 之間均呈現數個清晰的蛋白質條帶，兩者SDS-PAGE 圖譜存在較明顯差異，并且鹿茸蛋白質條帶數量多于鹿角；鹿角中蛋白質條帶較少，9 批樣品中穩定出現2 個清晰的蛋白質條帶，分別位于約75 kD（條帶a）、66.2 kD（條帶b）；9 批鹿茸片均出現4 個蛋白質條帶，分別位于約75 kD（條帶1）、61 kD（條帶2）、45 kD（條帶3）；20 kD（條帶4）；兩者穩定存在差異性蛋白質條帶為條帶b、條帶2、條帶3 和條帶4）。

圖1 鹿角的典型SDS-PAGE 蛋白質譜Fig.1 Typical SDS-PAGE protein profile of Cervi Cornu

圖2 鹿茸的典型SDS-PAGE 蛋白質圖譜Fig.2 Typical SDS-PAGE protein profile of Cervi Cornu Pantotrichum

3.2 2-DE 圖3～4 顯示，鹿角蛋白質斑點大多在Ⅰ區（pH5～7，Mw45 kD）、Ⅱ區（pH10，Mw66.2 kD），而在45～70 kD 之間少有分布；鹿茸蛋白質斑點則密集分布于Ⅲ區（pH5～7，Mw45 kD），并在pH5～6、Mw20 kD 的區域內存在3 個穩定出現的蛋白質斑點1～3。綜上所述，鹿角與鹿茸的2-DE 蛋白質圖譜存在較大差異，其蛋白質斑點分布具有明顯特征。

圖3 鹿角的典型2-DE 蛋白質圖譜Fig.3 Typical 2-DE protein profile of Cervi Cornu

圖4 鹿茸的典型2-DE 蛋白質圖譜Fig.4 Typical 2-DE protein profile of Cervi Cornu Pantotrichum

3.3 蛋白質生物質譜鑒定 鹿角與鹿茸蛋白質SDS-PAGE 條帶見圖5，可知分別劃分為2 個（CC-I、CC-Ⅱ）和4 個（CP-I、CP-Ⅱ、CP-Ⅲ、CP-Ⅳ）區域。

圖5 鹿角與鹿茸SDS-PAGE 切割條帶Fig.5 Protein bands cut from SDS-PAGE of Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum

圖6 顯示，鹿角與鹿茸蛋白質條帶經胰蛋白酶膠內消化后所得肽段的m／z主要分布于1 000～3 000，MASCOT 檢索結果見表2，可知分別從兩者中鑒定出2、4 個蛋白質。其中，從鹿茸蛋白質條帶CP-Ⅱ、CP-Ⅲ中分別鑒定出源于馬鹿的白蛋白（ALB）、馬鹿假定蛋白hypothetical protein Celaphus_00009169，partial，并且評分高于100，可信度較高。

表2 鹿角與鹿茸蛋白質鑒定結果Tab.2 Results for protein identification of Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum

圖6 鹿角與鹿茸中蛋白質的多肽MALDI-TOF-MS 質譜圖Fig.6 MALDI-TOF-MS spectra of peptide fragments from Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum proteins

4 討論

動物藥應用歷史悠久，一直受到醫藥學家和政府部門的重視，是中藥體系的重要組成部分。大多數動物藥的鑒定技術為性狀鑒定和顯微鑒定，這兩種方法要求供試品或為完整的藥材、飲片，或具有特定的微觀或宏觀的可視特征，因此難以作為識別角類中藥以及同屬近似種等的專屬性鑒定手段。本研究以鹿角與鹿茸的蛋白質為研究對象，分別進行SDS-PAGE 和2-DE 電泳分析。結果表明鹿角與鹿茸蛋白質的電泳圖譜中均存在穩定的蛋白質條帶或斑點且具有一定差異，這些差異性蛋白質條帶和蛋白質斑點為鹿角與鹿茸的鑒別提供了依據。

近年來利用現代分析技術鑒定動物藥的研究不斷增加，但主要是檢測小分子［15-16］；動物藥中小分子物質的種類遠少于植物藥，且特異性差，因此導致多味動物藥以同一小分子化合物為指標性成分缺乏專屬性。此外，由于特異性高，DNA 分子鑒定發展迅速，是黃璐琦院士提出并發展的“分子生藥學”的重要組成部分［17］。鹿角與鹿茸為不同采收時間所得到的鹿的角組織，兩者的DNA 分子具有物種內和個體內同一性，且基因序列相對保守，不易隨時間周期或環境變化而發生改變，因而難以根據鹿角與鹿茸的基因差異設計特異性引物以擴增目標片段，或以DNA 條形碼技術區分鹿角與鹿茸。但因鹿角與鹿茸采收時間的差異，蛋白質種類及含量均會發生改變，即同一物種不同組織中分別具有特異性高的標志蛋白質［18］，并且其會穩定表達。因此，相比于位點特異性PCR 技術等DNA分子鑒定方法，以標志蛋白質作為鹿角與鹿茸特征識別物的電泳分析方法則具有其獨特之處。

通過對鹿角與鹿茸的蛋白質條帶進行胰蛋白酶膠內消化，利用MALDI-TOF／TOF-MS 測定多肽片段并結合MASCOT 搜索匹配，鑒定多種可信度較高的蛋白質。該方法為角類中藥的專屬性鑒別研究提供了一條新的途徑。然而，由于 NCBI、SWISSPROT 等數據庫中鹿的蛋白質條目較少，因此匹配出的蛋白質數量不多。在進一步的研究中，可將含量較高的特異性蛋白質以柱層析法進行分離，然后通過液質聯用并結合轉錄組學和生物信息學研究手段［19-20］，解析標志蛋白質的結構。