核桃青皮提取物對CNE-2細胞增殖、遷移和侵襲的影響

陳 辰，胡麗霞

(武漢市第一醫院，湖北 武漢 430000)

核桃JuglansregiaL.歸于桃屬植物，廣泛分布于世界各地，不僅使用干種子(堅果)，還使用綠色核桃、貝殼、樹皮、綠殼和葉子，這些已用于化妝品和制藥行業[1]。核桃在傳統醫學中廣泛用于治療皮膚炎性反應、多汗癥、潰瘍及止瀉、抗蠕蟲、防腐和收斂等[2]，在一些歐洲國家，干核桃葉用于制備輸液[3]。核桃青皮又稱青龍衣，是植物核桃未成熟果實的外果皮，其為核桃果實收獲后的廢棄物，原料來源豐富。核桃在多種癌中均具有一定的抗癌功能，但其在鼻咽癌中的功能及機制尚未完全清楚。雖已有大量研究驗證miRNA在鼻咽癌中具有調控功能，但其中miR-564與鼻咽癌進展中的關系知之甚少。本研究擬以鼻咽癌細胞系CNE-2為研究對象，觀察核桃青皮提取物對鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲及miR-564、TPX2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 核桃(產地四川廣元)。人鼻咽癌細胞系CNE-2(中國科學院上海細胞庫)。DMEM培養基(美國Thermo公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(北京康為世紀生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美國Sellect公司)；反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PVDF膜(瑞士Roche公司)；SDS-PAGE 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；ECL發光液(上海碧云天生物技術有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；Matrigel基質膠、Transwell小室(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮提取物制備 將核桃剝去核桃青皮，在50 ℃下烘干，粉碎至90目篩，按照粉料比1∶15用無水甲醇在65 ℃下回流提取3次，減壓濃縮提取液至膏狀，即得，配制成100 mg/mL，再稀釋至20、40、80 μg/mL。

1.2.2 細胞培養與分組 將CNE-2細胞用DMEM培養基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素)培養，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養、傳代，隨機分為對照組和核桃青皮提取物組(0、20、40、80 μg/mL)，與對數增殖期的CNE-2細胞共培養48 h，選取40 μg/mL組細胞作為核桃青皮提取物組。采用脂質體法將miR-564 mimics、miR-NC轉染CNE-2細胞，作為miR-564 組、miR-NC組；將anti-miR-564、anti-miR-NC轉染CNE-2細胞，再用40 μg/mL核桃青皮提取物處理后，作為核桃青皮提取物+anti-miR-564組、核桃青皮提取物+anti-miR-NC組。

1.2.3 MTT法檢測細胞抑制率 將細胞密度調至1.0×105/mL，加入MTT溶液(5 g/L)和DMSO(0.5 g/L)反應，結束后在490 nm波長下檢測吸光度(A)，計算細胞抑制率，公式為細胞抑制率=[1-A490樣品/A490對照]×100%。

1.2.4 Western blot檢測TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達 將細胞充分裂解后提取總蛋白，作為蛋白電泳的上樣模板，電泳結束后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，一抗(兔單克隆TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14抗體，1∶500～1∶2 000)稀釋液孵育(4 ℃)過夜，二抗(辣根過氧化物酶標記的二抗，1∶500)稀釋液(37 ℃)孵育1 h，采用電化學發光試劑盒對膜進行顯影曝光。

1.2.5 細胞遷移、侵襲測定 采用傷口愈合測定法評估細胞遷移。細胞在6孔板中培養，每孔5×104個，達到90%～95%匯合后以無菌塑料微量移液器吸頭刮擦單層細胞，在標準條件下培養24 h。培養結束后，在顯微鏡觀察傷口恢復情況，計算劃痕愈合率。

采用Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲。先將細胞用不含血清的培養基培養12 h,密度調至1.0×105個/mL，取100 μL涂抹到小室的聚碳酸酯膜上表面，再取600 μL含血清的培養基置入小室(表面涂抹一層基質膠)，在37 ℃下培養12 h，緩緩移出小室，拭去膜上表面的多余細胞，甲醇固定，結晶紫染色，將膜下表面朝上置于載玻片進行封片，在顯微鏡下計數，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-564、TPX2 mRNA表達 提取總RNA，合成cDNA，在-20 ℃下保存，作為qRT-PCR實驗模板。以U6、GAPDH為內參，采用2-△△Ct法檢測miR-564、TPX2 mRNA表達。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 通過在線靶基因預測miRcode預測miR-564的潛在結合靶標，將預測到的TPX2-3 UTR互補結合位點[委托深圳華大基因設計合成TPX2-3 UTR WT(含有結合位點的TPX2-3 UTR片段)]和TPX2-3 UTR MUT(不含有結合位點的TPX2-3 UTR片段)克隆至熒光素酶報告載體psiCHECK2，構建熒光素酶報告基因載體質粒。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作，記錄螢火蟲和海腎的熒光素酶發光強度，以兩者比值表示細胞熒光活性。

2 結果

2.1 核桃青皮提取物對CNE-2細胞增殖的影響 與對照組比較，20 μg/mL組細胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達降低，p21、p27蛋白表達升高(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組細胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達降低，p21、p27蛋白表達升高(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組細胞抑制率升高，CyclinD1蛋白表達降低，p21、p27蛋白表達升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組CNE-2細胞增殖相關蛋白表達

表1 核桃青皮提取物對CNE-2細胞增殖的影響

2.2 核桃青皮提取物對CNE-2細胞遷移、侵襲的影響 與對照組比較，20 μg/mL組細胞劃痕愈合率、遷移數和侵襲數、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達均降低(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組細胞劃痕愈合率、遷移數和侵襲數、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達均降低(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組細胞劃痕愈合率、遷移數和侵襲數、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達均降低(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 核桃青皮提取物對CNE-2細胞遷移、侵襲的影響

注：A為遷移、侵襲相關蛋白表達，B為劃痕，C為Transwell檢測CNE-2細胞遷移、侵襲。圖2 各組CNE-2細胞遷移、侵襲

2.3 核桃青皮提取物對miR-564、TPX2表達的影響 與對照組比較，20 μg/mL組miR-564表達升高，TPX2 mRNA、蛋白表達均降低(P<0.05)；與20 μg/mL組比較，40 μg/mL組miR-564表達升高，TPX2 mRNA、蛋白表達均降低(P<0.05)；與40 μg/mL組比較，80 μg/mL組miR-564表達升高，TPX2 mRNA、蛋白表達均降低(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 各組TPX2蛋白表達

2.4 miR-564靶向調控TPX2表達 miR-564與TPX2 3 UTR存在的結合位點見圖4A。miR-564可抑制WT-TPX2細胞熒光活性(P<0.05)，而不影響MUT-TPX2細胞的熒光活性，見圖4B，并且能負向調控TPX2表達(P<0.05)，見表4～5。

2.5 miR-564過表達對CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-564組miR-564表達、細胞抑制率升高，劃痕愈合率、細胞遷移數、侵襲數降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達減少，p21蛋白表達增加(P<0.05)，見圖5、表6。

2.6 抑制miR-564表達逆轉CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲 與對照組比較，核桃青皮提取物組miR-564表達、細胞抑制率、p21蛋白表達升高，TPX2蛋白表達、劃痕愈合率、細胞遷移量、侵襲量及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低(P<0.05)；與核桃青皮提取物+ anti-miR-NC組比較，核桃青皮提取物+anti-miR-564組miR-564表達、細胞抑制率、p21蛋白表達降低，TPX2蛋白表達、劃痕愈合率、細胞遷移量、侵襲量及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達量均升高(P<0.05)，見圖6、表7。

表3 核桃青皮提取物對miR-564、TPX2表達的影響

圖4 各組TPX2表達

表4 雙熒光素酶報告實驗結果

表5 miR-564對TPX2表達的影響

圖5 各組CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達(Ⅰ)

表6 miR-564過表達對CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲的影響

表7 抑制miR-564表達逆轉CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲

圖6 各組CNE-2細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達(Ⅱ)

3 討論

核桃種子(核桃)、綠殼和葉子中甲醇和石油醚提取物具有對腎癌細胞和結直腸癌細胞相同的抗增殖活性[4]。核桃青皮提取物通過調節凋亡相關基因的表達，以劑量和時間依賴的方式抑制前列腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，表明核桃青皮提取物中存在活性化合物，是抗癌藥物的候選來源[5]。核桃青皮提取物呈濃度依賴性抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲；抗增殖和抗遷移侵襲功能與抑制增殖相關蛋白CyclinD1，促進p21、p27的表達和抑制遷移侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14的蛋白表達密切相關。

miR-564在人骨肉瘤細胞和組織中下調，且miR-564的過表達抑制癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，Akt被鑒定為miR-564的直接靶標，受miR-564的負向調控，表明miR-564通過直接靶向Akt抑制糖酵解和細胞增殖[6]。miR-564的表達量與核桃青皮提取物的濃度呈正相關；過表達miR-564可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并調控增殖相關蛋白和遷移侵襲相關蛋白的表達，miR-564可靶向TPX2。

TPX2在多種腫瘤中的表達發生異常，TPX2在癌細胞和組織中表達增加[7]。TPX2在多種惡性腫瘤中表現出異常的升高，抑制TPX2不僅可抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，甚至可增強放化療的面感性[8]。TPX2和AURKA的下調顯示出抑制癌細胞侵襲的作用，揭示了TPX2促進結腸直腸腺瘤的惡性化進展[9]。TPX2在結直腸癌中有促進癌癥惡化作用[10-11]。TPX2在結腸癌組織中過度表達，且與結腸癌的分期、轉移及生存率顯著相關，抑制TPX2在體外和體內均抑制結腸癌細胞的增殖和致腫瘤性，TPX2敲低可減弱結腸癌細胞的遷移和侵襲能力，顯示與AKT介導的MMP2活性在機制上相關，表明TPX2在促進人結腸癌的腫瘤發生和轉移中起重要作用，并且具有成為新的預后生物標志物和治療靶標[12]。TPX2的表達量與核桃青皮提取物的濃度呈負相關，且抑制TPX2具有與過表達miR-564相同的抑制鼻咽癌細胞細胞增殖，促進凋亡的作用；過表達TPX2可逆轉過表達miR-564對鼻咽癌細胞增殖抑制和凋亡促進的作用。

綜上所述，核桃青皮提取物具有抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與調節miR-564/TPX2表達密切相關，為核桃青皮提取物治療鼻咽癌提供支持。