鳳仙透骨草抗真菌有效部位化學成分的研究

顧媛媛，陳 媚，王連芝，張洪財，鄒迪新

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

鳳仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.來源于鳳仙花科鳳仙花屬鳳仙花的干燥莖，為一年生草本植物，性寒、味甘，微苦，具祛風除濕、活血、消腫止痛之功效[1]。千百年來，中醫廣泛用于治療甲溝炎、手足癬等細菌、真菌性疾病，歷代本草均有相關記載。為了探尋鳳仙透骨草抗真菌作用的藥效物質基礎，進一步開發利用該資源，本實驗在以往的研究基礎上[2-3]，繼續對鳳仙透骨草抗真菌活性部位即乙酸乙酯萃取部位進行深入系統的化學成分分離，得到14個化合物，其中，化合物8～9、13首次從該植物中分離得到的。

1 材料

Bruker-400型超導核磁共振光譜儀(德國Bruker公司)；Waters 2695型分析型HPLC、Waters 2996 APD檢測器、LCT Premier XE TOF-MS飛行時間質譜儀(美國Waters公司)；ZF-8D型暗箱四用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；柱色譜硅膠(青島海洋化工廠，80～100、200～300目)；薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；C18分析型色譜柱(美國DIKMA公司；5 μm，250 mm×4.6 mm)；密度計(沈陽市衛工玻璃計器廠)；RP-18反相板(德國Merck公司)；柱色譜用反相ODS(ODS-AM，日本YMC公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)。HPLC所用溶劑甲醇、乙腈(美國迪馬公司，色譜純)；提取分離試劑均為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)。

鳳仙透骨草于2011年采自黑龍江省蘭西縣，經黑龍江醫藥大學藥學院中藥資源與開發教研室王振月教授鑒定為鳳仙花屬植物鳳仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.，憑證標本(編號201107-10)保存于黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院。

2 提取與分離

將干燥的鳳仙透骨草20.0 kg，剪成小塊，用95%乙醇溶液加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，得乙醇提取物。將該乙醇提取物用水混懸后，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇梯度萃取多次，得到乙酸乙酯萃取物246.0 g。該部位經硅膠柱分離，采用二氯甲烷-甲醇(100∶1～15∶1)梯度洗脫，得到6個不同極性段流分Fr.1～Fr.6。Fr.1經硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脫并重結晶分離得化合物8(11.3 mg)、9(13.1 mg)。Fr.2用二氯甲烷-甲醇(85∶1)洗脫，Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(30∶70)洗脫得化合物1(23.0 mg)、13(9.5 mg)。Fr.3經硅膠柱二氯甲烷-甲醇(70∶1)梯度洗脫，Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(40∶60)分離得化合物3(6.6 mg)、6(10.4 mg)、7(11.0 mg)。Fr.4經硅膠柱二氯甲烷-甲醇(40∶1～0∶1)梯度洗脫，得Fr.4a～Fr.4c 3個亞流分，Fr.4a(40∶1)經制備HPLC甲醇-水(45∶55)分離得化合物2(7.2 mg)，Fr.4b(20∶1)經Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(20∶80)分離得化合物4(6.2 mg)、5(13.0 mg)。Fr.4c(0∶1)經反相中壓柱甲醇-水(35∶65)洗脫得化合物10(13.5 mg)。Fr.5經硅膠柱二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脫，反相中壓柱甲醇-水(30∶70)梯度洗脫，經制備HPLC甲醇-水(15∶85)洗脫分離得化合物14(14.3 mg)，再經制備HPLC洗脫分離得化合物11(16.7 mg)、12(13.8 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：淡黃色針狀結晶(甲醇)，mp182～183 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:3.90(3H,s,-OCH3),6.17(1H,s,H-3),7.72(2H,m,H-6,7)，8.11(2H,m,H-5,8);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:180.0(C-1),160.4(C-2),109.8(C-3),184.8(C-4),126.4(C-5),134.5(C-6),133.3(C-7),123.5(C-8),131.0(C-9),131.9(C-10),56.4(C-11)。以上數據與文獻[4]基本一致，故鑒定為2-甲氧基-1,4-萘醌。

化合物2：淡黃色粉狀結晶(甲醇)，mp172～173 ℃。ESI-MSm/z:219.1[M+Na]+，分子式C10H12O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=15.8 Hz,H-2),6.32(1H,d,J=15.8 Hz,H-3),7.16(1H,d,J=1.9 Hz,H-5),7.05(1H,dd,J=1.9,8.2 Hz,H-9),6.80 (1H,d,J=8.2 Hz,H-8),3.88(3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:127.7(C-1),111.6(C-2),149.3(C-3),150.5(C-4),115.9(C-5),124.0(C-6),146.9(C-7),116.4(C-8),170.9(C-9),56.4(C-10)。以上數據與文獻[5]基本一致，故鑒定為阿魏酸。

化合物3：淡黃色結晶(甲醇)，mp204～205 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.83(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.09 (1H,s,H-5),6.75 (1H,s,H-8),6.19(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.89 (3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:164.0(C-2),109.9(C-3),147.0(C-4),112.5(C-5),146.1(C-6),152.9(C-7),103.9(C-8),151.4(C-9),112.6(C-10)。以上數據與文獻[6]基本一致，故鑒定為東莨菪素。

化合物4：淡黃色粉末(甲醇)，mp276～278 ℃。ESI-MSm/z:287.0[M+H]+，分子式C15H10O6。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.89(2H,d,J=10.4 Hz,H-3′,5′),8.07(2H,d,J=10.4 Hz,H-2′,6′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:148.0(C-2),137.1(C-3),177.3(C-4),158.2(C-5),99.2(C-6),16.6(C-7),94.4(C-8),162.5(C-9),104.5(C-10),123.7(C-1′),130.6(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),160.5(C-4′)。以上數據與文獻[7]基本一致，故鑒定為山柰酚。

化合物5：白色針狀晶體(甲醇)，mp210～212 ℃。ESI-MSm/z:191.0[M+Na]+，分子式C8H8O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.87(3H,s,3-OCH3),7.55(1H,dd,J=8.7,1.9 Hz,H-6),6.82(1H,d,J=8.7 Hz,H-5),7.53(1H,d,J=1.9 Hz,H-2);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.0(CO),152.6(C-4),148.6(C-3),125.2(C-6),123.0(C-5),115.8(C-2),113.7(C-1),56.3(-OCH3)。以上數據與文獻[8]基本一致，故鑒定為香草酸。

化合物6：淡黃色針狀結晶(甲醇)，mp272～274 ℃，ESI-MSm/z:179.0[M+H]+，分子式C9H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.16(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),7.77(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.74(1H,s,H-8),6.92(1H,s,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:164.3(C-2),112.8(C-3),146.0(C-4),113.0(C-5),144.5(C-6),152.0(C-7),103.6(C-8),150.4(C-9),112.4(C-10)。以上數據與文獻[9]基本一致，故鑒定為七葉內酯。

化合物7：白色晶體狀粉末(甲醇)，mp194～198 ℃，ESI-MSm/z:177.0[M+Na]+，分子式C7H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.42(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.40(1H,dd,J=9.6,1.9 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=9.6 Hz,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.2(-COOH),151.5(C-4),146.0(C-3),123.9(C-1),123.1(C-6),117.7(C-2),115.7(C-5)。以上數據與文獻[10]基本一致，故鑒定為原兒茶酸。

化合物8：白色粉末(甲醇)，mp792～794 ℃，ESI-MSm/z:383.4[M+H]+，分子式C25H50O2。1H-NMR(400 MHz,C5D5N)δ:0.86(3H,t,J=6.7 Hz,-CH3),1.25～1.41(44H,m,22×-CH2),1.79(2H,m),2.51(2H,t,J=7.4 Hz);13C-NMR(100 MHz,C5D5N)δ:176.0(-COOH),29.8(-CH2),14.3(-CH3)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為二十五烷酸。

化合物9：白色片狀結晶(氯仿)，mp162～166 ℃，ESI-MSm/z:413.4[M+H]+，分子式C29H48O。1H-NMR(400 Hz,CDCl3)δ:5.15(2H,dd,J=8.6,12.8 Hz,H-22,23),5.02(1H,dd,J=8.6,15.1 Hz,H-7),3.59(1H,m,H-3),1.02(3H,d,J=6.6 Hz,21-CH3),0.84(3H,d,J=6.4 Hz,27-CH3),0.78～0.80(9H,3×-CH3),0.54(3H,s,18-CH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.5(C-8),138.1(C-22),129.4(C-23),117.4 (C-7),71.0(C-3),55.8(C-17),55.1(C-14),51.2(C-24),49.4(C-9),43.2(C-13),40.8(C-20),40.1(C-5),39.4(C-12),37.9(C-4),37.1(C-1),34.2(C-10),31.8(C-25),31.4(C-2),29.6(C-6),28.5(C-16),25.3(C-28),23.0(C-15),21.5(C-11),21.3(C-21),21.0(C-27),18.9(C-26),13.0 (C-19),12.2 (C-29),12.2(C-18)。以上數據與文獻[12]基本一致，故鑒定為α-菠甾醇。

化合物10：黃色針狀晶體(甲醇)，mp314～316 ℃，鹽酸鎂粉反應呈陽性結果，Molish反應陰性，ESI-MSm/z:303.0[M+H]+，分子式C15H10O7。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,s,J=2.1 Hz,H-6),6.38(1H,s,J=2.1 Hz,H-8),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.62(1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′)，7.72(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:177.3(C-4),165.5(C-7),162.5(C-5),158.2(C-9),148.7(C-4′),147.9(C-2),146.2(C-3′),137.2(C-3),124.1(C-1′),121.6(C-6′),116.2(C-5′),115.9(C-2′),104.5(C-10),99.2(C-6),94.4(C-8)。以上數據與文獻[13]基本一致，故鑒定為槲皮素。

化合物11：黃色結晶(氯仿)，mp238～240 ℃，鹽酸鎂粉反應呈陽性結果，Molish反應陽性，ESI-MSm/z:465.0[M+H]+，分子式C21H20O12。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.20(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),6.86(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.58(1H,dd,J=2.2,8.5 Hz,H-6′),7.70(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:159.0(C-2),135.6(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.8(C-6),166.0(C-7),94.6(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),123.1(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.0(C-5′),123.0(C-6′),104.2(C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.2(C-4″),78.1(C-5″),62.5(C-6″)。以上數據與文獻[14]基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12：淡黃色粉末，鹽酸鎂粉反應呈陽性，Molish反應呈陽性，mp173～175 ℃，ESI-MSm/z:449.0[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.87(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),8.04(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,H-6′),6.19(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz)為端基糖質子信號；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)中給出了19個碳信號，δ:159.0(C-2),135.4(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.9(C-6),166.0(C-7),94.7(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),122.8(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.5(C-5′),122.0(C-6′),104.0 (C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.3(C-4″),78.0(C-5″),62.6(C-6″)。以上數據與文獻[15]基本一致，故鑒定為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13：紅色油狀物，ESI-MSm/z:279.2[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CDC13)δ:0.97(d,J=6.8 Hz,6H,H-3″,H-4″),0.93(d,J=7.6 Hz,3H,H-4′),7.52(2H,m,J=3.3,5.8 Hz,H-3,H-4),7.71(2H,m,J=3.3,4.4 Hz,H-2,H-5)，4.30(2H,t,J=6.6 Hz,H-1′),4.08(2H,d,J=6.7 Hz,H-1″),2.00～2.06(1H,m,H-2″),1.67～1.74(2H,m,H-2′),1.38～1.46(2H,m,H-3′);13C-NMR(100 MHz,CDC13)δ:132.3(C-1),132.3(C-2),128.8(C-3),130.9(C-4),130.9(C-5),128.8(C-6),167.6(C-1a),167.6(C-2a),71.7(C-1′),27.7(C-2′),19.1(C-3′),19.1(C-4′),65.5(C-1″),29.7(C-2″),30.5(C-3″),13.7(C-4″)。以上數據與文獻[16]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸正丁異丁酯。

化合物14：白色固體，溶于甲醇，mp196～198 ℃，Molish反應陽性，異羥肟酸鐵反應陽性，ESI-MSm/z:341.1[M+H]+，分子式C15H16O9。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:6.29(1H,d,J=9.2 Hz,H-3),7.82(1H,d,J=9.2 Hz,H-4),7.03(1H,s,H-8),7.20(1H,s,H-5),4.96(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),3.22～3.96歸屬于葡萄糖上的其他質子信號；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：163.6(C-2),114.8(C-3),145.6(C-4),113.9(C-5),150.5(C-6),149.6(C-7),105.4(C-8),103.1(C-1′),74.7(C-2′),77.5(C-3′),71.3(C-4′),78.6(C-5′),62.4(C-6′)。以上數據與文獻[17]基本一致，故鑒定為七葉苷。

4 討論

迄今為止，鳳仙透骨草化學成分的研究多集中在花及其種子，其莖的化學成分研究則很少[18]。為了尋找其有效成分，進一步開發利用該植物資源，本實驗對鳳仙透骨草的抗真菌有效部位乙酸乙酯萃取物進行成分研究，從中分離鑒定了14個化合物，包括有機酸、黃酮及萘醌等成分。其中，化合物8～9、13為首次從該植物中分離得到的，在一定程度上豐富鳳仙透骨草和鳳仙花屬植物的化學成分。本研究通過進一步研究鳳仙透骨草抗真菌的物質基礎，并篩選成分與生物活性的相關性，以期為綜合利用該植物資源提供理論依據。