基于網絡藥理學研究當歸揮發油治療失眠的作用機制

朱麗云，鐘 鈺，柳小莉，鄭 琴*，李文靜，任桂林，肖 帥

(1.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004；2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；3.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000)

失眠，又稱為“不寐癥”，是指患者對睡眠時間和(或)質量不滿足并影響其日間社會功能的一種主觀體驗[1]。據統計，我國目前有3億的失眠患者，這個數字正逐年增加并趨于年輕化。長期的慢性失眠會導致肥胖[2]、糖尿病、高血壓[3-4]、心腦血管[5]等疾病，還會導致焦慮癥、抑郁癥等精神疾病[6]。目前臨床治療失眠常見的藥物有苯二氮卓類和非苯二氮卓類受體激動劑、褪黑素受體激動劑、食欲素受體拮抗劑、抗組胺受體藥以及鎮靜類抗抑郁藥[7-8]，長期使用會產生依賴性、宿醉、嗜睡、體質量增加以及第2天眩暈等副作用[9]。盡管失眠現象普遍存在，但發病機制仍未有清晰的定義，因此，尋找新療法、新方法仍是當下研究的主要方向。

當歸始載于《神農本草經》，又名云歸、西歸、秦歸，為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性溫、辛、甘，入肝、心、脾經，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功能[10]?，F代藥理研究發現，當歸揮發油中的藁本內酯通過緩解氯胺酮興奮中樞的作用，緩解實驗動物的躁動不安，具有較強的鎮靜作用[11]。通過腹腔注射藁本內酯，可顯著降低戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期，延長睡眠持續時間[12]。然而當歸揮發油治療失眠的機制尚未明確，本研究主要是通過GC-MS分析當歸揮發油的主要化學成分，采用網絡藥理學分析預測當歸揮發油治療失眠的作用機制及物質基礎，為當歸揮發油防治失眠的機制研究提供理論依據。

1 材料

1.1 藥材 當歸(產地甘肅岷縣，批號20201210)經江西中醫藥大學藥學院劉榮華教授鑒定為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，質量符合2020年版《中國藥典》第一部的要求。

1.2 試劑與儀器 無水乙醇(批號2011039)、無水硫酸鈉(批號2009032)購自西隴科學股份有限公司，均為分析純。DZTW控溫電熱套(北京市永光明醫療儀器有限公司)；HLD-30002型電子天平(杭州友恒稱重設備有限公司)；Agilent 7 890 A/5975C型GC-MS儀器(美國安捷倫公司)。

2 方法

2.1 當歸揮發油提取 參考文獻[13]方法，精密稱取當歸中藥材粗粉100.00 g，裝入2 L圓底燒瓶中，加入1 000 mL水，浸泡2 h，提取8 h，收集提取器中的當歸揮發油，加入適量的無水硫酸鈉，靜置、脫水，即得當歸揮發油。

2.2 當歸揮發油GC-MS分析 氣相色譜條件[14]，HP-5MS毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；進樣口溫度230 ℃采用程序升溫(80 ℃以3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min；以2 ℃/min升至202 ℃；以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；載氣為高純氦氣；體積流量1 mL/min；進樣量1 μL。質譜條件，離子源溫度230 ℃；電子轟擊電離源，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描范圍35～550m/z。

2.3 當歸揮發油化學成分鑒定 數據處理采用Data Analysis軟件完成。將其閾值調整為16，對當歸揮發油化學成分進行篩選。所分辨的質譜在NIST 17.L標準譜庫中檢索，根據匹配度、保留指數和文獻已報道物質進行核對，確定當歸揮發油主要活性成分。

2.4 當歸揮發油主要活性成分靶點的篩選 通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫篩選當歸揮發油主要活性成分作用靶點。所獲得的靶點導入UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)中，靶點名稱限定物種為人，規范靶點名稱，獲得UniProt號。

2.5 失眠潛在作用靶點的篩選 通過Therapeutic Target Datebase數據庫(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/)以及OMIM數據庫(https://omim.org/)以“insomnia”作為關鍵詞進行檢索失眠相關靶點。刪除重復靶點，通過UniProt數據庫校正為官方名稱。

2.6 當歸揮發油成分-失眠靶點網絡構建 通過venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線數據庫將獲得的當歸揮發油成分靶點與失眠疾病靶點取交集，將交集靶點作為潛在靶點，潛在靶點對應的化學成分視為潛在活性成分。將當歸揮發油的活性成分和靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建當歸揮發油活性成分作用靶點的網絡圖，預測當歸揮發油治療失眠的主要靶點和活性成分。

2.7 蛋白-蛋白互作(PPI)網絡的構建 將潛在靶點導入STRING 11.0數據庫[15]中，設置Organism為人類“Homosapiens”，以置信度(combined score)≥0.40為篩選標準，PPI結果以tsv格式下載，導入Cytoscape 3.7.1軟件，運用Network Analyzer插件對靶點進行運算分析，以拓撲參數度值(degree)大于各節點度值平均數的靶點為關鍵靶點，繪制PPI網絡。

2.8 信號通路與生物過程分析 將潛在靶點導入生物學信息注釋數據庫[16-17](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier選擇“official gene symbol”，List Type設置為“gene list”，物種選擇為“Homosapiens”，設定閾值P<0.01。對當歸揮發油防治失眠的靶點進行geneontology選項下(GO，功能富集分析)生物過程(biology process)和Pathways選項下(KEGG，基因組百科全書)信號通路富集分析，獲得當歸揮發油與疾病之間的生物過程和信號通路富集分析。利用在線繪圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將其結果進行可視化。

2.9 靶點-組織分布網絡構建 通過The Human Protein Atlas數據庫[18]，查找潛在靶點組織分布，下載tsv的格式文件，對數據表達量(NX)大于10的的組織或器官(tissue)進行分析，應用Cytoscape 3.7.1軟件構建靶點-組織網絡。

3 結果

3.1 當歸揮發油的GC-MS分析結果 通過GC-MS分析鑒定出了14個化學成分，如圖1所示，相對含量為當歸揮發油的99.57%，其中最高的是Ligustilide(81.70%)、trans-beta-Ocimene(7.96%)，見表1。

圖1 當歸揮發油GC-MS總離子流圖

3.2 潛在靶點的篩選 采用TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction數據庫獲得的成分靶點，TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM數據庫獲得的疾病靶點，分別剔除重復靶點，得到144個成分靶點和172個疾病靶點，兩者取交集得到41個交集靶點，作為潛在靶點。

3.3 PPI網絡分析 如圖2所示，包含了38個節點，161條邊。運用Cytoscape 3.7.1中Network Analyzer插件對靶點進行運算分析，degree平均值為8.47，degree值表示靶點之間的相互作用，其值越大，節點也越大，表明當歸揮發油可能通過作用于這些關鍵靶點得以在失眠癥中發揮作用。根據靶點運算分析結果，SLC6A4的degree值最大，其次是CHRNA4、DRD2、HTR2A等，見表2。

3.4 當歸揮發油成分-靶點網絡分析結果 如圖3所示，有54個節點，其中化合物節點12個，靶點節點41個，126條邊，每條邊代表當歸揮發油成分-疾病靶點之間的相互作用，用degree值表示，節點大小代表degree值大小(紅色三角形節點代表當歸，綠色V形節點代表化學成分，藍色圓形節點代表潛在靶點)，degree值越大與節點連接的靶點越多。在網絡中，有16個節點的degree值≥ 4.67(平均值)，有效成分節點有9個，見表3。

表1 當歸揮發油主要化學成分

圖2 核心靶點相互作用網絡圖

圖3 當歸揮發油成分-靶點網絡圖

表2 關鍵靶點信息

表3 成分-靶點網絡圖中關鍵節點成分信息

3.5 GO生物過程分析 使用DAVID數據庫進行GO生物富集分析得到104個條目，以條形圖展示排名前20的通路，其中包含63個生物過程(BP)條目，25個分子功能(MF)條目和16個細胞組成(CC)條目，見圖4。生物過程主要涉及G-蛋白偶聯受體信號通路(G-protein coupled receptor signaling pathway)、氯離子跨膜轉運(chloride transmembrane transport)、γ-氨基丁酸信號通路(gamma-aminobutyric acid signaling pathway)、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路(adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)、細胞增殖(cell proliferation)等；分子功能主要涉及質膜(plasma membrane)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、神經元細胞體(neuronal cell body)、GABA-A 受體復合物(GABA-A receptor complex)、氯離子通道復合體(chloride channel complex)等；細胞組成主要涉及細胞外配體門控離子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)、GABA-A受體活性(GABA-A receptor activity)、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、腎上腺素結合(epinephrine binding)、苯二氮卓受體活性(benzodiazepine receptor activity)等。

3.6 KEGG信號通路分析 使用DAVID數據庫進行KEGG信號通路分析得到18條信號通路(P<0.01)，如圖5所示，主要涉及神經活動配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)、γ-氨基丁酸能突觸(GABAergic synapse)、膽堿能突觸(Cholinergic synapse)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)等。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集通路

3.7 組織-靶點分布圖 通過整理分析，共獲得2 483條組織數據，對數據表達量NX大于10的組織進行分析，篩選出280條組織(tissue)數據，見圖6(綠色圓形節點代表交集靶點，紅色菱形節點代表組織或器官靶點，度值越大，節點越大)。結果表明41個潛在靶點分別在基底神經節、大腦皮層、嗅覺、腦橋和髓質、海馬等組織中表達。

圖6 組織-靶點網絡圖

4 結論

網絡藥理學是以系統生物學為基礎，通過多學科的交叉應用和整體生物網絡的整合與分析，構建藥物與疾病作用靶點間的相互作用，闡述中藥活性成分間的協同作用，通過“中藥-成分-疾病靶點”網絡圖，探討藥物與疾病間的相互作用，為藥物開發與應用提供理論依據[19]。

研究表明，當歸揮發油主要是由苯酞類化合物、苯酚類二聚體、萜類、酚類及烷烴化合物為主，其藁本內酯(Ligustilide)含量最高,其次是丁烯基酞內酯[3-Butylisobenzofuran-1(3H)-one][20]。現代藥理研究發現[21]，當歸揮發油對中樞神經系統具有抑制作用，通過腹腔注射藁本內酯98、196 mg/kg，均能抑制小鼠的自發活動，延長戊巴比妥鈉誘導的睡眠持續時間，降低體溫，抑制電刺激誘發的激怒反應(P<0.01)。王宇等[22]研究發現，藁本內酯能結合和激動GABAA受體的苯二氮卓類位點，達到鎮靜、抗焦慮、抗癲癇的作用。丁烯基酞內酯是當歸揮發油中苯酞類活性成分，研究發現其不僅是有效的5-HT和去甲腎上腺素再攝取的抑制劑，而且對單氨氧化酶具有一定的抑制作用[23]。Deng等[24]發現苯酞類二聚體化合物Riligustilide、Gelispirolide與GABA受體具有較號的結合能力，這表明苯酞類化合物具有防治失眠的潛力。

通過GC-MS結果分析顯示，當歸揮發油主要包含Ligustilide、trans-beta-Ocimene、Z-Butylidenephthalide等14種活性成分，對當歸揮發油進行檢索和篩選，獲得14種成分對應144個靶點。通過PPI網絡分析表明，當歸揮發油中SLC6A4、CHRNA4、DRD2、HTR2A、CHRM1等靶點治療失眠的可能性較大。SLC6A4、HTR2A是色氨酸途徑中的關鍵調控基因，維持5-HT的穩態[25]。CHRNA4是神經元nAChR的主要基因，其突變可能與神經系統疾病有關[26]。DRD2廣泛存在于中樞神經系統中，是最重要的多巴胺自身受體[27]。綜上所述，當歸揮發油中的關鍵靶點可能是通過調節神經系統內穩態，從而防治失眠，間接證明網絡藥理學是預測成分靶點的有力工具。

核心靶點與組織分布結果表明，41個潛在靶點在神經遞質中高表達。KEGG結果顯示，當歸揮發油治療失眠潛在作用靶點主要涉及G-蛋白偶聯受體信號通路、氯離子跨膜轉運、γ-氨基丁酸信號通路等生物過程，主要涉及細胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性等分子功能，主要涉及質膜、神經元細胞體、GABAA受體復合物等細胞組成。主要與神經活動配體-受體相互作用、鈣信號通路、γ-氨基丁酸能突觸、膽堿能突觸、cGMP-PKG信號通路、5-羥色胺能突觸等通路有關。當歸揮發油的活性成分主要與以上生物過程、分子功能、細胞組成以及信號通路達到治療失眠癥的目的。

綜上所述，當歸揮發油治療失眠的作用靶點，分布于不同的代謝通路，多成分、多靶點以及多通路的相互作用是治療失眠癥的特點。研究結果初步驗證了當歸揮發油的作用機制和基礎藥理學作用，為進一步研究探討作用機制提供了理論依據及研究方向。