益腎調經方對卵巢儲備功能減退大鼠顆粒細胞凋亡的影響

嚴如根仇華何靜劉恭雪曹煥澤陳銀蔡平平李長忠

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南250355； 2.濟南市中醫醫院，山東 濟南250012； 3.盱眙縣中醫院，江蘇 淮安211700； 4.山東第一醫科大學附屬省立醫院，山東 濟南250012）

卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是女性在40 歲之前發生的卵巢內卵母細胞質量下降和（或）數量減少，伴隨體內性激素紊亂，最終導致月經異常及生育力下降［1-2］。DOR 病人如若延誤病情，失治誤治可最終演變成為卵巢早衰，嚴重干擾了女性的身心健康［3］。鑒于DOR 的發病機制尚不明確，目前西醫主要采用激素補充療法，雖然短期療效理想肯定，但長時間使用會刺激影響到患者的心臟、乳腺、子宮等器官，增加罹患心臟疾病、子宮內膜癌、乳腺癌、靜脈血栓等疾病的機率，因此患者的可接受度較低［4-6］。

中醫藥在調經促孕方面的運用歷史悠久、療效突出，且無明顯毒副作用，2017 年中國關于早發性卵巢功能不全專家診治共識中就提到了中醫中藥可以作為改善卵巢功能的非激素治療［7］。益腎調經方作為臨床經驗用方，能夠有效改善患者的卵巢功能，保護女性生育力，但其具體作用機制尚不明確。本研究使用雷公藤多苷片混懸液灌胃構建DOR 大鼠模型，探討益腎調經方對DOR 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的抑制作用及其對相關凋亡因子的影響，以期為DOR 的臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 8 周齡SPF 級SD 雌性大鼠60只，體質量（180±50）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（魯）2019-0003。每籠5 只飼養于山東第一醫科大學附屬省立醫院SPF 級動物房（室溫21～25 ℃、相對濕度為50%～60%），自由飲水攝食，室內照明由專人控制（晝夜12 h／12 h）。本研究所涉及的動物實驗均符合動物倫理委員會的準則（批準號2019-014）。

1.2 藥物 雷公藤多苷片（湖南千金協力藥業有限公司，批號Z43020138）；戊酸雌二醇片（德國拜耳公司，批號J20130009）；黃體酮膠囊（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H20041902）；益腎調經方由熟地黃12 g、當歸12 g、醋龜甲10 g、山藥20 g、酒萸肉12 g、酒蓯蓉20 g、醋香附15 g、黨參20 g、丹參15 g、黃芪20 g、枸杞子20 g、淫羊藿15 g、菟絲子20 g、八月札15 g 組成，本實驗主要采用中藥顆粒劑，益腎調經方生藥共計226 g／劑，根據顆粒劑說明書與生藥等量換算，相當于免煎顆粒43.5 g／劑，中藥免煎顆粒由江陰天江藥業有限公司有償提供。

1.3 試劑 革蘭氏染色液（批號G1060）、蛋白提取試劑盒（批號BC3710）均購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL 染色試劑盒（批號G1501-50T）、RNA 提取試劑盒（批號G3013）、逆轉錄試劑盒（批號G3330-100）、PCR 試劑盒（批號G3320-05）、內參一抗（批號GB11002）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；蛋白濃度檢測試劑盒（批號P0012）購自上海碧云天生物技術有限公司；caspase-3 一抗（批號66470-2-Ig）、Bax 一抗（批號60267-1-Ig）、Bcl-2 一抗（批號26593-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.4 儀器 熒光定量PCR儀，瑞士羅氏公司；電泳儀、電轉儀，美國伯樂公司；全波長酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；化學發光成像儀，美國GE 公司；全自動真空組織脫水機，美國Thermo 公司；顯微鏡，德國徠卡公司。

2 方法

2.1 動物篩選及分組 60 只8 周齡SD 大鼠適應性喂養1周，接連3 個動情周期（12 d）陰道涂片，確定每只大鼠有正常的動情周期后，隨機挑選10 只設為空白組，其余50只隨機分成模型組，益腎調經方高、中、低劑量組，激素序貫組，每組10 只。

2.2 動物造模 參考文獻［8］報道，大鼠連續14 d 灌胃給予雷公藤多苷片混懸液（50 mg／kg）進行造模，于造模第8 天起進行大鼠陰道涂片并用革蘭氏染色，如果涂片結果顯示動情周期≥6 天或停滯在某一時期≥3 天者，視為動情周期紊亂，并提示造模成功［9］。

2.3 給藥 建模成功后，參照人與大鼠之間藥物劑量換算方法進行計算［10］，益腎調經方中劑量組灌胃給予人臨床等效劑量，即4.6 g／kg；益腎調經方高、低劑量給予人臨床劑量2、0.5倍，即9.2、2.3 g／kg；激素序貫組灌胃給予戊酸雌二醇片（0.1 mg／kg）聯合黃體酮膠囊（21 mg／kg）；空白組、模型組給予等容量生理鹽水灌胃，連續給藥15 d，給藥結束后進行陰道涂片，于動情前期采血并取雙側卵巢組織待測。

2.4 檢測指標

2.4.1 陰道脫落細胞涂片 將耳鼻喉棉棒蘸取適量0.9%NaCl 溶液，輕輕放入大鼠陰道，順時針方向輕刮宮頸口1周，將含有陰道脫落細胞的分泌物均勻涂在玻璃載片上，干燥后使用革蘭氏染色鏡檢。正常大鼠動情周期分為以白細胞為主的動情間期、以有核上皮細胞為主的動情前期、以角化細胞為主的動情期以及三者兼具的動情后期，周期為4～5 d，規律且穩定。

2.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色 大鼠卵巢組織置于4%多聚甲醛固定24 h 后脫水、石蠟包埋，連續切成約4 μm病理切片，進行漂片、攤片、烤片、HE 染色、透明并封片，于顯微鏡下觀察。

2.4.3 TUNEL 染色檢測大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況 取“2.4.2”項下制備的病理切片，按照TUNEL 染色試劑盒說明書操作，染色觀察大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況，細胞凋亡率＝（凋亡細胞數／細胞總數）×100%。

2.4.4 免疫組織化學技術（IHC）檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取“2.4.2”項下制備的病理切片，經切片、攤片、烤片、脫蠟、檸檬酸抗原修復、封閉、一抗及二抗孵化、DAB 顯色、蘇木素復染，封片后于顯微鏡下觀察。根據陽性細胞面積總和占視野面積的百分比進行統計分析。

2.4.5 Western blot 檢測大鼠卵巢組 織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取部分卵巢組織，提取蛋白后并檢測濃度，蛋白煮沸變性，經過配膠、上樣、電泳、轉膜、封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗搖床慢搖孵育1 h，TBST 清洗3次，每次15 min，ECL 法顯影。

2.4.6 RT-qPCR 檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表達 取部分卵巢組織，按照試劑盒說明書步驟提取RNA，并測得RNA 濃度，逆轉錄后選用GAPDH作為內參，檢測caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表達情況，并通過擴增曲線得到CT值，以2-△△CT法進行相對定量分析，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，如果檢驗樣本資料呈現正態性分布且滿足方差齊性，采用方差分析及t檢驗；不符合則采用非參數檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 益腎調經方對DOR 大鼠動情周期的影響 由表2 可知，與空白組比較，模型組大鼠動情周期停滯、延長或無明顯動情周期（P＜0.01），說明造模后大鼠體內性激素分泌異常，抑制了大鼠卵巢功能；與模型組比較，經過益腎調經方及激素序貫給藥15 d后，大鼠紊亂的動情周期時間縮短，趨向規律（P＜0.05，P＜0.01）。大鼠各動情周期陰道脫落細胞學染色結果見圖1。

圖1 大鼠陰道脫落細胞學（×50）

表2 各組大鼠動情周期的比較（， n＝10）

表2 各組大鼠動情周期的比較（， n＝10）

注：與空白組比較，** P＜0.01；與模型組比較，＃ P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 益腎調經方對DOR 大鼠卵巢病理變化的影響 如圖2所示，空白組大鼠卵巢的皮質和髓質在光鏡下清晰可見，皮質下富含結構和形態正常的各級卵泡及黃體，且間質腺少見，髓質內的血管、神經及淋巴管豐富，未見局部充血、變性壞死等病理變化；模型組大鼠可見卵巢皮質增厚，各級生長卵泡均減少，閉鎖卵泡增加，間質腺多見，髓質萎縮；經益腎調經方及激素序貫給藥后，卵巢皮質增厚減輕，各級生長卵泡均多于模型組，閉鎖卵泡及間質腺少見，髓質略萎縮。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理變化（HE，×100）

3.3 益腎調經方對DOR 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率降低（P＜0.01），見表3、圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織TUNEL 染色（×200）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（， n＝10）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（， n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 免疫組化檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達的變化 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bax 表達均升高（P＜0.01），Bcl-2表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bax 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見表4、圖4。

圖4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 表達（IHC，×200）

表4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 陽性細胞面積占比（%，， n＝10）

表4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 陽性細胞面積占比（%，， n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 Western blot 檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的變化 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase-3、Bax 蛋白表達升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，益腎調經方各劑量組大鼠卵巢組織caspase-3、Bax 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖5～6。

圖5 各組大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白條帶圖

3.6 益腎調經方對DOR 大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織Bax、caspase-3 mRNA 表達升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織caspase-3、BaxmRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖7。

圖7 各組大鼠卵巢組織中Bax、 Bcl-2、 caspase-3 mRNA 表達（， n＝10）

4 討論

卵巢儲備功能減退（DOR）作為卵巢早衰的已病，而卵巢早衰作為卵巢儲備功能減退的未病，深入研究DOR，對于有效阻止和延緩卵巢早衰的發生具有重要意義，彰顯了中醫學“未病先防”“既病防變”的重要思想。經驗方益腎調經方緊扣DOR 脾腎虧虛為本，氣滯血瘀為標的重要病機，在施諸“補”“舒”法同時，輔以活血化瘀之法，臨床療效顯著。方中菟絲子、淫羊藿、肉蓯蓉溫補腎陽；龜板、熟地、枸杞子、山藥補腎養陰，寓有陰中求陽，陽中求陰之意；黃芪、黨參健脾益腎，益后天而養先天；丹參、當歸溫潤養血，化瘀調經；八月札、香附理氣疏肝；山萸肉補益肝腎，諸藥聯用，共奏補腎健脾，疏肝活血之功。

顆粒細胞凋亡引發卵母細胞質量下降，甚則導致卵泡閉鎖是形成DOR 的重要病理基礎［11-12］。顆粒細胞作為卵巢的最主要功能細胞，其與卵母細胞的相互交流對卵母細胞的發育和成熟起著不可替代的作用［13］。此外，顆粒細胞上含有卵泡賴以生長的卵泡刺激素和促黃體生成素受體，所以顆粒細胞的存在與否直接決定著卵泡的發育和閉鎖［14］。因此，本實驗從顆粒細胞凋亡角度出發探討益腎調經方治療DOR 的作用機制。由于雷公藤多苷片的生殖毒性［15］，被廣泛應用于誘導DOR 大鼠模型［16-17］，結果證實其與人類DOR 臨床及組織學特征較為相符［18］。本研究采用雷公藤多苷片造模后，與空白組比較，模型組大鼠動情周期明顯紊亂，且大鼠各級生長卵泡及卵泡中的顆粒細胞層數明顯減少，表明本次實驗造模成功。

圖6 各組大鼠卵巢組織中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達（， n＝10）

細胞凋亡指在基因嚴格控制下，由促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和凋亡調控因子等共同參與的細胞程序性死亡，是機體重要的自我穩態機制［19-20］。Bcl-2 屬于抗凋亡基因，是協調細胞生命和死亡的關鍵因子［21］；Bax 大多位于細胞質，屬于促凋亡基因。正常情況下，Bax 與Bcl-2 可產生同源或者異源二聚體來控制細胞凋亡，但如果這種平衡關系被各種凋亡信號刺激破壞，就會發生細胞凋亡［22-23］。細胞凋亡的線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑都是經過活化caspase 家族［24］，繼而影響底物蛋白，加速蛋白分解而觸發凋亡。caspase-3 作為細胞凋亡中的重要效應因子，其大多位于Ⅰ型細胞程序性死亡有序級聯反應下游，是caspase 家族中最關鍵的執行者，通常認為caspase-3 是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必由之路，其被激活預示著凋亡步入不可逆階段［25］。

本實驗結果表明，益腎調經方可以有效改善DOR 大鼠的動情周期，增加DOR 大鼠各級生長卵泡及顆粒細胞。同時，其能提高DOR 大鼠卵巢組織中抗凋亡因子Bcl-2 的表達，降低促凋亡因子caspase-3、Bax 的表達。綜上所述，益腎調經方可能通過影響DOR 大鼠卵巢中相關凋亡指標抑制顆粒細胞凋亡，阻止并延緩卵泡發生閉鎖，從而實現改善DOR 大鼠卵巢功能的目的。