基于網絡藥理學研究活血調脂方對糖尿病性脂肪肝糖脂代謝的作用

周濤濤徐定昌平菁張春枚孫繼佳王雨秾*

（1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海201203； 2.上海中醫藥大學數學與物理教研室，上海201203）

中國的糖尿病性脂肪肝患者數量預計在未來的幾十年將大規模增加［1］，嚴重代謝紊亂帶來的健康問題將引起巨大的醫療負擔［2-8］，活血調脂方是上海中醫藥大學附屬龍華醫院肝病科副主任醫師王雨秾副教授的經驗方，針對糖尿病性脂肪肝脾虛濕盛兼夾血瘀的特點配伍而成，在臨床診療中發現該方具有很好的降低糖尿病性脂肪肝患者肝脂肪水平的作用。

通過篩選活血調脂方中的有效成分以及糖尿病性脂肪肝的治療靶點，以建立藥物有效成分-靶點-疾病網絡并進行GO 功能和KEGG 富集分析，運用網絡藥理學方法揭示并體外驗證活血調脂方治療糖尿病性脂肪肝的作用機制。

1 方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 有效成分的收集與篩選 活血調脂方由丹參、西紅花、荷葉、絞股藍、土茯苓、蒼術、徐長卿7 味藥配伍而成，分別通過TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）、TCMID（http：／ ／119.3.41.228：8000／tcmid／search／）對藥物成分進行收集，并補充《中藥大辭典》［9］收錄的成分，再與PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫進行核驗校 對。利 用 SwissADME（http：／ ／www.swissadme.ch／index.php）在線數據分析軟件，以Lipinski、ESOL Class、GI absorption、Bioavailability Score 為指標，對活血調脂方中的化學成分進行篩選，Lipinski 取0；ESOL Class 為化合物溶解性指標，在篩選時除去評價為“poorly soluble”的成分；Bioavailability Score 為口服利用度得分，取值≥0.55；“GI absorption”是評價化合物的胃腸道吸收的情況，保留評價為“high”的成分。

1.1.2 有效成分和疾病的靶點預測和識別 使用SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）、HitPick（http：mips.helmholtzmuenchen.de／proj／hitpick）和 SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／index.php）數據庫對有效成分進行靶點預測。在DisGeNET（http：／ ／disgenent.org／home／）、DrugBank（https：／ ／go.drugbank.com／）、OMIM（https：／ ／omim.org／）和TTD（http：／ ／db.idrblab.net／ttd／）數據庫分別收集2 型糖尿病和非酒精性脂肪性肝病相關的基因，使用Venny 2.1.0 在線分析系統（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）將2 個病從4 個數據庫中收集到的靶點基因取交集得到2 個病的交集基因，即得到糖尿病性脂肪肝的相關基因。

1.1.3 構建有效成分-靶點-疾病網絡圖 將有效成分、藥物作用靶點和疾病相關基因輸入Cytoscape 3.8.1 構建了活性成分-靶點-疾病網絡圖，可視化有效成分和相關靶點之間的作用關系，并使用Network-Analyzer 插件對網絡圖進行分析。

1.1.4 靶點GO 功能與KEGG 富集分析 引用R 語言數據包對疾病相關基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，并且根據P值和基因數目自動生成GO 功能和KEGG 富集注釋圖。選取P＜0.01 的3 條核心通路運用Cytoscape 3.8.1軟件構建靶點-通路網絡圖。

1.1.5 構建PPI 網絡與模塊分析 將有效成分與糖尿病性脂肪肝的交集基因導入STRING（https：／ ／string-db.org／）數據庫，設置Organism 參數為Homo Spaiens，將Combine Score 閾值取為0.4。使用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件對KEGG 富集得到的3 條核心通路的關鍵蛋白基因進行分析，得到關鍵蛋白基因的Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Netowork 評分。

1.1.6 分子對接驗證 通過分子對接技術將有效成分-靶點-疾病網絡圖中Degree 值大于19 的有效成分與KEGG 富集得到的3 條核心通路的關鍵蛋白進行分子對接驗證。在Pubchem 下載有效成分的2D 結構，再使用ChemBio3D Ultra 14.0 軟件對2D 結構按照最小自由能進行優化得到小分子配體文件。通過PDB 數據庫（http：／ ／www1.rcsb.org／）得到核心靶點的pdb 結構文件，再使用Pymol 軟件（https：／ ／pymol.org／2／）去除核心靶點pdb 結構文件中的水分子和小分子配體得到蛋白受體文件。將小分子配體文件和蛋白受體文件導入AutoDockTools 1.5.6 軟件計算每對小分子配體和蛋白受體文件最佳結合的區域，通過AutoDock Vina 軟件（http：／ ／vina.scripps.edu／）進行半柔性分子對接計算得到每對小分子和作用靶點的親和力值（affinity）。使用Discovery Stuido 2019 軟件繪制有效成分與靶點的結合構像圖并標注出結合位點。

1.2 實驗材料

1.2.1 細胞 人肝癌細胞HepG2 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2.2 試劑與藥物 丹參（批號200914）、西紅花（批號202010）、絞股藍（批號201022）、荷葉（批號20201015）、土茯苓（批號200917）、蒼術（批號20201013）、徐長卿（批號200812）均購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院。鹽酸二甲雙胍（批號S30880）購自上海源葉生物科技有限公司；阿昔莫司（批號32200925）購自魯南貝特制藥有限公司。GAPDH 抗體（批號AF1186）購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號WB0123）購自上海威奧生物技術有限公司；細胞因子信號轉導抑制因子3（SOCS-3）抗體、固醇調節元件結合蛋白-1C（SREBP-1C）、HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（批號ab16030、ab28481、ab205718）購自英國 Abcam公司；脂聯素（Adiponectin）抗體、過氧物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、胰島素受體底物1（IRS-1）、磷酸化胰島素受體底物1（Phospho-IRS-1）、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化糖原合成激酶-3（Phospho-GSK-3）、Akt、Phospho-Akt（批 號 2789T、2435T、3407T、2385T、12456T、5558T、4691T、4058T）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2.3 活血調脂方制備 參照臨床給藥劑量，稱取活血調脂方藥材丹參36 g，荷葉36 g，絞股藍84 g，蒼術24 g，土茯苓84 g，徐長卿84 g，西紅花2 g，用蒸餾水充分浸沒煎煮2 h，湯液過濾除渣，用旋轉蒸發儀（溫度設置50 ℃，轉速40 r／min）將濾液濃縮至膏狀，將浸膏-80 ℃冷凍24 h后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，得粉率為8.14%，收集干燥粉末樣品，-20 ℃密封保存。稱取1 g 活血調脂方凍干粉溶解于10 mL 去離子水中，充分震蕩搖勻，配制成100 mg／mL的活血調脂方母液，3 000 r／min 離心10 min，經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20 ℃冰箱中保存備用，臨用時用培養基稀釋成不同劑量。

1.3 實驗方法

1.3.1 油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調脂方對HepG2 細胞存活率的影響 以每孔1×104個細胞密度接種于96 孔板中，用含不同劑量油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調脂方的培養基孵育24 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）在37 ℃繼續孵育4 h，棄去孔內液體后，加入150 μL 二甲基亞砜，并通過酶聯免疫檢測儀檢測570 nm 波長處的光密度（OD）值。基于對照組的結果，將獲得的OD值進行歸一化處理，并計算各組細胞存活率。

1.3.2 活血調脂方對HepG2 細胞胰島素抵抗模型的影響 參考文獻［10］報道配制棕櫚酸鈉溶液，對照組不作處理；模型組用含有指定劑量棕櫚酸鈉溶液孵育24 h；活血調脂方組在棕櫚酸鈉溶液孵育24 h 后給予不同劑量活血調脂方繼續孵育24 h，二甲雙胍組則加2.5 mmol／L 二甲雙胍。對照組、模型組、活血調脂方組、二甲雙胍組均取半數給予100 nmol／L 胰島素刺激，另一半不作處理，同時在無血清的高糖培養基再孵育4 h，比較各組間細胞對胰島素的敏感性。葡萄糖水平檢測參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 活血調脂方對HepG2 細胞脂肪肝模型的影響 參考文獻［11］報道配制油酸鈉溶液，細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素／鏈霉素的DMEM 高糖培養基中，于5%CO2、37 ℃下培養。對照組不作處理；模型組用指定劑量油酸鈉溶液孵育24 h；活血調脂方組在油酸鈉溶液處理24 h后給予不同劑量活血調脂方再繼續孵育24 h，陽性組則加1 mmol／L 阿昔莫司。甘油三酯檢測和油紅O 染色（×100）參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達 以每孔3.5×105個細胞密度接種于6 孔板，設置對照組、模型組、陽性組（二甲雙胍組或阿昔莫司組）和活血調脂方低、中、高劑量組。對照組正常孵育；模型組使用指定劑量棕櫚酸鈉或油酸鈉溶液孵育24 h；活血調脂方組在棕櫚酸鈉或油酸鈉溶液處理24 h 后給予不同劑量活血調脂方再繼續孵育24 h，陽性組則加2.5 mmol／L 二甲雙胍或1 mmol／L 阿昔莫司。收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經凝膠電泳，轉至NC膜，脫脂牛奶封閉2 h，分別加入GAPDH（1∶1 000）、IRS-1（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）、p-GSK-3β（1∶ 1 000）、Akt（1∶ 1 000）、p-Akt（1∶1 000）、SREBP-1C（1∶ 1 000）、SOCS-3（1∶ 1 000）、Adiponectin（1∶1 000）和PPARγ（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000），37 ℃孵育2 h，ECL 發光試劑盒顯影，使用ImageJ 1.8.0_172 軟件進行半定量分析。

1.4 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學差異。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 活血調脂方中的有效成分 從TCMSP、TCMID、《中藥大辭典》 中共獲得成分347個，其中丹參53個，荷葉11個，絞股藍36個，西紅花43個，蒼術93個，土茯苓61個，徐長卿50 個。利用SwissADME 對成分進行篩選后得到198 個有效成分。

2.1.2 活血調脂方治療疾病的靶點基因 通過SEA、HitPick、SwissTargetPrediction 得到有效成分的靶點基因411個。通過DisGeNET、DrugBank、OMIM、TTD 4 個數據庫得到糖尿病性脂肪肝相關基因234 個。通過取交集得到活血調脂方治療糖尿病性脂肪肝的54 個作用靶點，并在GeneCard 數據庫中對所有靶點基因再次核驗。

2.1.3 構建有效成分-靶點-疾病網絡圖 建立有效成分-靶點-疾病網絡圖（圖1）更加全面地揭示活血調脂方治療糖尿病性脂肪肝的有效成分和作用靶點之間的作用關系。其中，藍色是有效成分，紅色是有效成分作用于糖尿病性脂肪肝的靶點基因。該網絡顯示了1 107 個節點和404 條邊，具有更大的度值和更多邊緣的節點發揮更加重要的作用，用Cytoscape 3.8.1 軟件中的Network Analyzer 插件進行分析選取Degree 值大于19 為核心成分，具體見表1。

圖1 成分-靶點-疾病網絡圖

表1 核心成分表

2.1.4 GO 功能分析 使用R 語言clusterProfiler 數據包得到活血調脂方作用靶點的GO 功能分析注釋圖（圖2A），基于P＜0.05 得到1 381 個GO 條目，其中生物進程1 262個，細胞結構34個，分子功能85 個。在生物進程中，交集靶點主要富集在脂肪酸代謝過程、對異源生物刺激的反應、類固醇代謝過程等條目；在細胞結構中，交集靶點主要富集在細胞頂端部分、神經細胞體、膜筏等條目；在分子功能中，交集靶點主要富集在血紅素結合、四吡咯結合、鐵離子結合等條目。

2.1.5 KEGG 富集分析 使用R 語言clusterProfiler 數據包得到活血調脂方作用靶點的KEGG 富集分析注釋圖，基于P＜0.05 得到32 條通路，圖2B 上顯示P＜0.01 的15 條通路主要與癌癥、免疫、氧化應激、代謝、生物降解、耐藥性、信號轉導、病毒性疾病等內容相關。在15 條通路中PPAR信號通路、非酒精性脂肪性肝病、胰島素抵抗這3 條通路與疾病關系最為密切，圖2C 顯示了靶蛋白在預測通路上的分布，紅色表示靶蛋白，藍色為體外實驗驗證的重要位點，并使用Cytoscape 3.8.1 軟件構建這3 條通路的靶點-通路網絡圖（圖2D），在此基礎上開展了后續的機制驗證。

圖2 GO 功能分析和KEGG 富集分析

2.1.6 PPI 核心網絡 使用STRING 構建PPI 網絡圖（圖3），共有節點54個，220 條邊，每個節點平均有8.15 條邊，局部聚類系數為0.394。使 用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件對KEGG 富集得到的3 條核心通路的關鍵蛋白基因進行評分，關鍵蛋白基因的得分情況見表2。

表2 靶點蛋白評分表

圖3 蛋白互作網絡圖

2.1.7 分子對接 通過分子對接研究發現活血調脂方中的核心有效成分quercetin（槲皮素）、3beta-hydroxyatractylon、kaempferol（山柰酚）、alpha-eudesmol（α-桉葉醇）、［（4S）-2-oxo-4-［（E）-1-oxobut-2-en-2-yl］-3，4-dihydropyran-5-yl］acetate、isorhamnetin（異鼠李素）、resveratrol（白藜蘆醇）、myristic acid（肉豆蔻酸）與7 個關鍵通路蛋白GSK3B、INSR、GLUT1、LXRA、PI3K、PPARγ、FABP 的親和力值小于-5 kcal／mol，如表3 所示，說明這些有效成分與核心靶點結合穩固［12］，能夠改善或治療糖尿病性脂肪肝。選擇親和力值小于-7 kcal／mol 的關鍵蛋白和活性分子繪制對接模式圖，見圖4。

圖4 活血調脂方治療糖尿病性脂肪肝的重要靶點與活性成分的分子對接

表3 Vina 分子對接結果表

2.2 細胞實驗

2.2.1 油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調脂方對HepG2 細胞存活率的影響 如圖5 所示，與對照組比較，0.8（低劑量）、1.2（中劑量）、1.6 mg／mL（高劑量）活血調脂方、1 mmol／L油酸鈉和150 μmol／L 棕櫚酸鈉的處理對細胞存活率無明顯影響（P＞0.05），生存率均大于90%，表明沒有顯著的細胞毒性，可以用于造模和給藥。

圖5 細胞毒性實驗

2.2.2 活血調脂方對HepG2 細胞糖脂代謝的影響 如圖6～7 所示，與未添加胰島素刺激的對照組比較，胰島素增加了細胞的葡萄糖消耗（P＜0.05），棕櫚酸鈉處理的模型組對胰島素的刺激敏感性下降，并且葡萄糖消耗量相比于對照組下降了15.6%，這表明棕櫚酸鈉誘導成功建立了胰島素抵抗模型。與模型組比較，活血調脂方中、高劑量組細胞葡萄糖消耗增加（P＜0.05），并且胰島素刺激后葡萄糖消耗也增加（P＜0.05），表明中、高劑量活血調脂方增加HepG2 細胞的葡萄糖攝入，同時改善了胰島素敏感性；活血調脂方低劑量組葡萄糖消耗增加（P＜0.05），但胰島素刺激后葡萄糖消耗情況無明顯變化（P＞0.05）。

圖6 活血調脂方對糖代謝的影響

通過GPO-PAP 酶法檢測不同濃度活血調脂方對HepG2細胞脂肪肝模型中TG 水平和脂質積累的影響。如圖7A 所示，模型組的TG 水平約為對照組的3.7 倍。與模型組比較，低劑量給藥組的TG 水平降低約15.4%，中劑量約為24.6%，高劑量約為47.2%。此外，通過顯微鏡觀察油紅O 染色后細胞內脂質積累的差異，如圖7B 所示，與對照組比較，模型組染色更深，表明模型組細胞內脂質積累增加，而中藥給藥組之間的著色程度隨著藥物劑量的增加而遞減。

圖7 活血調脂方對糖脂代謝的影響

2.2.3 活血調脂方對胰島素信號通路的影響 如圖8 所示，與對照組比較，棕櫚酸鈉誘導的模型組p-IRS-1 和p-Akt 表達降低（P＜0.05），p-GSK-3β 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血調脂方組細胞p-IRS-1、p-Akt 表達升高（P＜0.05），p-GSK-3β 表達降低（P＜0.05）；與活血調脂方低劑量組比較，活血調脂方中、高劑量組細胞p-IRS-1、p-Akt 表達升高（P＜0.05），p-GSK-3β 的表達降低（P＜0.05）。結果表明，活血調脂方改善了胰島素的信號傳導，使得糖異生減少，肝糖原合成增加，減少了脂肪酸的合成。

圖8 活血調脂方對胰島素信號通路的影響

2.2.4 活血調脂方對脂代謝通路的影響 如圖9 所示，與對照組比較，模型組細胞SREBP-1C、SOCS-3、PPARγ 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血調脂方各劑量組細胞Adiponectin、PPARγ 表達升高（P＜0.05），SOCS-3、SREBP-1C 表達降低（P＜0.05）；與活血調脂方低劑量組比較，活血調脂方中、高劑量組細胞SREBP-1C、SOCS-3 表達降低（P＜0.05），Adiponectin 表達升高（P＜0.05），活血調脂方中劑量組PPARγ 表達升高（P＜0.05）。結果表明，活血調脂方減少了脂肪酸的從頭合成，增加了脂肪酸的燃燒和能量的消耗，并改善胰島素抵抗。

圖9 活血調脂方對HepG2 細胞脂質代謝通路的影響

3 討論

細胞實驗表明活血調脂方可以增加葡萄糖的攝入改善胰島素抵抗同時減少肝細胞內甘油三酯的堆積，網絡藥理學的分析結果提示活血調脂方可能通過胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、PPAR 信號通路這三條通路調節糖脂代謝，胰島素信號傳導路徑IRS-1／AKT／GSK-3β 在胰島素抵抗的發生中起關鍵作用［13］。脂聯素是一種抗炎脂肪因子，可以減少肝糖原生成并增加脂肪酸氧化，有助于治療和預防糖尿病性脂肪肝，PPARγ 的激活可以顯著抑制脂多糖引起的炎癥反應，同時增加脂聯素的表達［14］。SOCS-3 的過表達可以導致胰島素抵抗和肝臟脂肪酸合成的關鍵調節因子SREBP-1C 的增加，對SOCS-3 表達的抑制作用可以改善胰島素敏感性降低肝脂肪水平和血脂水平［15］。

中醫認為糖尿病性脂肪肝其成因可歸為內外因2 部分，外因多是貪食高粱肥甘之味，生濕釀痰；內因則主要是脾失健運，肝失疏泄。病位主要涉及肝脾，病久則五臟皆受累，多見脾虛濕盛兼夾血瘀，治宜健脾祛濕，活血降脂。活血調脂方由丹參、荷葉、絞股藍、西紅花、蒼術、土茯苓、徐長卿7 味藥物組成。丹參是近20 年來中醫藥治療糖尿病性脂肪肝使用頻次最高的藥物［16］，尚濤等［17］發現丹參可在改善胰島素抵抗基礎上進一步改善脂代謝和肝功能。絞股藍提取液可以通過增強線粒體磷脂的穩定性進而預防脂質蓄積和氧化應激，對糖尿病性脂肪肝患者有益［18］。荷葉可以增強大鼠的脂質代謝并降低血液中甘油三酯水平［19］。蒼術的揮發油可以實現體外降血糖，是治療高血糖的潛在藥物［20］。本研究運用網絡藥理學還發現土茯苓和西紅花均含有槲皮素；肉豆蔻酸存在于土茯苓、西紅花、徐長卿等藥物中；另外西紅花中還富含異鼠李素、山柰酚等活性成分。活血調脂方主要組分能夠調控GSK3B、INSR、PI3K、PPARγ 等54 個靶點，介導PPAR 信號通路、非酒精性脂肪性肝病、胰島素抵抗等32 條通路，參與脂肪酸代謝過程、對異源生物刺激的反應、類固醇代謝過程等生物進程從而治療糖尿病性脂肪肝。本研究通過生物信息學結合體外實驗，初步驗證了活血調脂方治療糖尿病性脂肪肝的理論基礎。

綜上所述，活血調脂方是治療糖尿病性脂肪肝的一種“多成分，多靶點，多路徑”的臨床復方，其作用機制主要是改善糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，本研究為中醫復方治療糖脂代謝紊亂相關疾病提供新思路和新方法，為后續研究復方調控糖尿病性脂肪肝提供新的理論依據并指導臨床用藥。