基于網絡藥理學研究益腎消癥方治療多囊卵巢綜合征的作用機制

丁昉黃莉婷何佳林寒梅

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧530020； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧530023）

多囊卵巢綜合征是一種多基因、多因素、全身性、炎癥性的自身免疫性疾病［1-2］，一般由雄激素過多和卵巢功能障礙的體征和癥狀組合定義，其發病機制尚未完全明確［3］。青春期多囊卵巢綜合征具有高發性，其臨床癥狀包括閉經或少經、多毛癥、不育癥、情緒障礙等［4］，此外對非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病、冠狀動脈硬化等心血管疾病及子宮內膜癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤的長期風險也不容忽視［5-9］。本課題組在臨床使用益腎消癥方發現，其對青春期多囊卵巢綜合征患者的療效優于二甲雙胍及達英-35 對照組，且不良反應減少［10］。網絡藥理學是基于系統生物學、生物信息學及經典藥理學等多學科理論對藥物干預疾病的靶點及可能機制進行系統歸納分析的新學科［11-12］。本文通過網絡藥理學方法，構建“藥物-成分-疾病-靶點”的交互網絡，聯合大鼠多囊卵巢綜合征模型，對益腎消癥方治療多囊卵巢綜合征的作用靶點及機制進行探究。

1 材料

1.1 網絡藥理學數據庫 中醫藥百科全書數據庫（ETCM，http：／ ／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／）；人類基因數據庫（GeneCards，https：／ ／www.genecards.org／）；Venny 2.1.0（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）；String 數據庫（https：／ ／string-db.org／）；DAVID數據庫（http：／ ／www .david.niaid.nih.gov）；RCSB PDB數據庫（https：／ ／www.rcsb.org）；PubChem 數據庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）。

1.2 試劑與藥物 益腎消癥方由黨參20 g、仙靈脾12 g、杜仲15 g、菟絲子15 g、女貞子10 g、三棱12 g、莪術10 g、赤芍9 g、膽南星10 g、半夏15 g、夏枯草12 g、當歸15 g、川芎10 g、皂角刺12 g、紫石英15 g 等組成，中藥材均購自廣西省南寧市老百姓大藥房，經廣西中醫藥大學黃莉婷老師鑒定為正品。益腎消癥方由廣西中醫學院中藥方劑研究實驗室制備，每1 劑（約192 g）浸泡2 h 后加入2 L 水煎煮2 h，取煎煮液。同法煎煮6次，合并所有煎煮液，于60 ℃水浴濃縮至4 g／mL，消毒滅菌，4 ℃保存，備用。丙酸睪酮注射液（批號050601）、0.9%氯化鈉注射液（批號07011103）均購自廣州白云山明興制藥有限公司；注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG，批號0605021），購自上海上藥第一生化藥業有限公司；枸櫞酸氯米芬膠囊（CC，批號060801），購自上海衡山藥業有限公司。

1.3 儀器 OHAUS 1／1000 型電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；BCD-143KA1 型電冰箱（TCL 科技集團股份有限公司）；PM-10AD 型照相顯微鏡（日本Olympus 公司）；Leica MP60 型顯微照相系統、RM2125 型LEICA 切片機（德國Leica 公司）。

1.4 動物 SPF 級雌性SD 大鼠40只，體質量30～35 g，23 日齡，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（桂）2003-0003。飼養條件為室溫（25±2）℃，相對濕度40%～70%，12 h／12 h 明暗交替，自由飲水進食。

2 方法

2.1 益腎消癥方有效成分收集及初篩 利用ETCM 數據庫收集益腎消癥方中各藥味的主要化學成分，并用ETCM 數據庫中的MedChem Studio 程序預測查詢該化學成分的潛在靶點，保留可靠性分值大于0.8 的靶點。

2.2 疾病靶點預測及交互靶點 以polycistic ovary syndrome 作為檢索詞納入GeneCards 數據庫中，高級檢索獲得多囊卵巢綜合征相關靶點。通過網絡藥理學蛋白交集Venny 2.1.0 在線工具取交集獲得“益腎消癥方”和“多囊卵巢綜合征”交集的“中藥-疾病”交互靶點，并繪制韋恩圖。

2.3 蛋白互作（PPI）網絡構建 將所得到的交互靶點導入，通過String 數據庫，限定物種為Homo sapiens，設定最低要求互動分數為“medium confidence”（＞0.4），其余設置均為默認設置，得到PPI 網絡相關信息。

2.4 GO 和KEGG 富集分析 將交集靶標導入DAVID 數據庫中，進行基因功能富集分析，分別從細胞組成、分子功能、生物過程方面提供基因功能的詳細注釋。設定閾值P＜0.05 進行篩選，對相互作用的靶點進行GO 富集分析，按照P值升序選取前10 位KEGG 通路，繪制“靶點-通路”弦圖。并用R 軟件對上述結果進行可視化分析。

2.5 分子對接 從RCSB PDB 數據庫下載靶標蛋白，并使用PyMol 軟件刪除水分子和原配體；有效化合物從PubChem 下載2D 結構，用ChemBio3D 能量最小化轉化為三維結構，保存為mol2 格式。以蛋白作為受體，以小分子作為配體，根據靶蛋白復合物中配體的坐標確定分子對接的活性位點，采用AutoDock Vina 進行分子對接，參數exhaustiveness 設置為24，其他參數均采用默認值。最后選取打分值最高的構象用Discovery Studio 進行結果分析，用PyMol 進行相關作圖。

2.6 多囊卵巢綜合征大鼠造模及給藥 參照文獻［13］報道，雌性SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、枸櫞酸氯米芬組、益腎消癥方組，每組10只，除正常組外，其余各組建立多囊卵巢綜合征大鼠模型，造模方法為頸背部皮下注射丙酸睪酮1.25 mg／只，隔天1次，同時給予HCG 1.5 U／只，每天2 次皮下注射，連續20 d。正常組皮下注射生理鹽水0.15 mL／只，每天2次，共20 d。造模成功后，各組大鼠每天灌胃給予相應藥物（益腎消癥方組2 g／100 g，枸櫞酸氯米組0.5 mg／100 g），共4 周；正常組和模型組大鼠灌胃給予蒸餾水0.5 mL／100 g。

2.7 檢測指標

2.7.1 陰道細胞學檢查觀察動情周期 無菌棉簽于生理鹽水中浸濕后放入大鼠陰道側壁上1／3，順時針涂抹后沿同一方向涂抹于載玻片上，95%乙醇中固定15 min，自然風干后采用HE 染色。大鼠動情周期以陰道內細胞變化來鑒別，動情前期以小、圓、有核鱗狀上皮細胞存在為特征，持續時間12 h；動情期以角質化鱗狀上皮細胞為特征，持續時間9～15 h；動情后期，以白細胞和角質化細胞為特征，持續時間14～18 h；動情間期，白細胞和圓上皮細胞出現為特征，持續時間60～70 h。

2.7.2 雙側卵巢檢測 大鼠腹腔麻醉后摘取雙側卵巢稱取濕質量，觀察各組大鼠卵巢外觀、色澤、包膜及包膜下是否有囊狀擴張的卵泡等情況，檢測雙側卵巢的體積和質量，用10%甲醛固定液固定后行HE 染色。

2.8 統計學分析 通過SPSS11.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 益腎消癥方有效化學成分篩選 通過ETCM 數據庫檢索得到益腎消癥方中包含559 個化合物，這些化合物中可靠性大于0.8 的靶點共計797 個。各藥味的化合物和靶點個數見表1。

表1 益腎消癥方包含的化合物和對應的潛在靶標個數

2.2 多囊卵巢綜合征靶點預測及“益腎消癥方-多囊卵巢綜合征”交互靶點篩選 通過GeneCards 數據庫數據，以polycistic ovary syndrome 作為檢索詞收集得到“多囊卵巢綜合征”靶點共計2 575 個。通過網絡藥理學蛋白交集Venny 2.1.0 在線工具獲得“益腎消癥方”和“多囊卵巢綜合征”交集的“中藥-疾病”交互靶點共252個，韋恩圖見圖1。

圖1 益腎消癥方與多囊卵巢綜合征交互靶點韋恩圖

3.3 “益腎消癥方-多囊卵巢綜合征”交互靶點PPI 網絡構建 利用STRING 數據庫對交互靶點進行蛋白互作網絡分析，繪制PPI 網絡圖（圖2），圖中網絡節點為251個，相互作用連線有3 054條，平均度值為24.3。節點表示作用靶點，節點間的連線則表示靶點間具有相互作用，互相關聯。

圖2 交互靶點PPI 網絡圖

3.4 GO 富集分析 從DAVID 生物信息在線數據庫中確定GO 條目867條，其中，生物學過程（biological process，BP）612條，主要涉及對藥物、乙醇、缺氧、尼古丁等反應性，氧化還原過程，對RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的起始及正調控，類固醇激素介導的信號通路及代謝過程，突觸傳遞及膽堿能等；細胞組成（cellular component，CC）84條，涉及乙酰膽堿門控通道復合物、胞質溶膠、細胞器膜、質膜、細胞外泌體、膜筏、突觸后膜和核苷酸激活的蛋白激酶復合物等；分子功能（molecular function，MF）171條，與藥物、酶、乙酰膽堿、血紅素、鐵離子、氧等結合，類固醇激素受體，乙酰膽堿激活的陽離子選擇性通道，配體門控離子通道，乙酰膽堿受體等活性密切相關。以上分析均取排名前10 條目作圖，見圖3。

3.5 KEGG 富集分析 將疾病和藥物交集的關鍵靶點輸入String 數據庫，共富集到211 條通路。根據P＜0.05 選取排名前10 的通路作圖，見圖4。分析富集結果可知，益腎消癥方-多囊卵巢綜合征交互靶點涉及雌激素信號通路、神經活性配體-受體相互作用、類固醇激素的合成、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、胰島素抵抗及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等疾病。

圖4 KEGG 富集分析結果（前10）

3.6 分子對接結果 將交互靶點PPI 網絡圖的TSV 文件導入Cytoscape 3.6.0 軟件中分析節點信息，篩選出前6 個核心調控基因靶點，結果見表2。以潛在靶標數＞40 以及ETCM 上類藥性（DL）評分＞0.5 作為篩選條件得到主要潛在活性成分，與核心調控基因靶點進行對接，結果發現大部分成分均具有較好對接活性。選取類藥性評分最高（0.823），潛在靶標數為44 的喬松素作為代表性成分，與INS（圖5A）、ALB（圖5B）、Akt1（圖5C）進行分子對接進行分析驗證。其中，喬松素小分子與INS 蛋白氨基酸Gly20 和Phe24 形成3 個氫鍵，與氨基酸Phe24 形成2 個ππ 作用；與ALB 蛋白氨基酸Arg117 和Arg186 形成2 個氫鍵，與氨基酸Tyr138 和Tyr161 形成2 個π-π 作用；與Akt1蛋白的氨基酸Asn279 和Asp292 形成2 個氫鍵，這些相互作用使得化合物喬松素能與INS、ALB、Akt1 等蛋白形成穩定的復合物，與蛋白的活性口袋有較好匹配。

圖5 喬松素與INS、ALB、Akt1 分子對接圖

表2 益腎消癥方治療多囊卵巢綜關鍵靶點拓撲學分析

3.7 益腎消癥方對大鼠動情周期的影響 正常組大鼠均表現為規律動情周期；模型組中11 只大鼠無交替變化的規律動情周期，提示排卵障礙；益腎消癥方組有4 只大鼠表現規律動情周期變化，6 只則呈不規律動情周期變化；枸櫞酸氯米芬組中有3 只大鼠呈規律動情周期變化，7 只呈不規律動情周期變化，見表3。

表3 益腎消癥方對大鼠動情周期的影響

3.8 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響 正常組大鼠卵巢表面飽滿光滑，色澤較紅，體積較小；模型組大鼠卵巢表面較蒼白，體積增大，包膜增厚，可見包膜下較多囊狀擴張的卵泡；益腎消癥方組大鼠卵巢與模型組比較則有明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠雙側卵巢質量增加（P＜0.01）；與模型組比較，益腎消癥方組大鼠卵巢質量降低（P＜0.01），枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢質量降低，但無統計學意義（P＞0.05），見表4。正常組大鼠卵巢結構正常，可見多個黃體及不同發育階段卵泡，顆粒細胞呈多層，排列整齊；模型組大鼠卵巢可見大量原始卵泡，存在多個囊性竇卵泡，竇腔擴大，顆粒細胞層數減少排列稀疏，黃體組織減少；益腎消癥方組大鼠囊性卵泡壁顆粒細胞層次增加，排列整齊，優勢卵泡內見有卵細胞，且黃體數量較模型組的增多，黃體體積增大，見圖6。

表4 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響（， n＝10）

表4 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖6 各組大鼠卵巢結構圖（×100）

4 討論

多囊卵巢綜合征多起病于青春期，以月經失調、高雄激素血癥、胰島素抵抗為基本特征［5，14］。我國傳統醫學將多囊卵巢綜合征歸屬于“月經后期、閉經、月經過少、崩漏、不孕、癥瘕”等范疇［15-17］。現代中醫學多認為該病以臟腑功能失調為本，痰瘀阻滯為標，臨床表現多為虛實夾雜，本虛標實之證［18］。

基于多年臨床經驗及動物實驗的基礎，林寒梅教授自擬益腎消癥方，方中紫石英、淫羊藿、杜仲補腎壯陽，溫暖胞宮為君；菟絲子補陽益陰，女貞子養陰補血，黨參益氣養血，當歸、川芎養血活血，共為臣藥，共奏補腎活血之效；三棱、莪術、皂角刺活血化瘀軟堅散結；膽南星、半夏、夏枯草化痰散結；赤芍活血散瘀；以上諸藥為佐藥，配合君、臣藥以加強益腎活血、化痰消癥之功［10］。該方已應用于多囊卵巢綜合征的臨床治療，取得了良好療效，為了更好發揮益腎消癥方的治療作用，本研究采用網絡藥理學對全方作用機制進行探究。結果顯示，益腎消癥方可能通過調控雌激素信號通路、類固醇激素合成、胰島素抵抗等通路來發揮對多囊卵巢綜合征的治療作用，這與降低體內雄激素的生成、改善胰島素抵抗和降低胰島素水平［13］等多囊卵巢綜合征治療的要點相吻合。動物實驗發現，益腎消癥方可抑制大鼠卵巢異常增大，增加卵巢黃體組織數量，改善卵巢竇狀卵泡卵母細胞多囊樣改變，恢復多囊卵巢綜合征大鼠動情周期，改善多囊卵巢大鼠的排卵障礙。該治療機制可能是通過對顆粒細胞和卵泡膜細胞的作用，降低多囊卵巢大鼠雄激素水平，促進卵母細胞生長擴大，與其他因素（如雄激素、胰島素等）協同或拮抗作用，反饋調節促性腺激素的產生，使卵泡正常成熟發育，恢復排卵。分子對接結果顯示，益腎消癥方中主要潛在活性成分喬松素與核心調控基因靶點INS、ALB、Akt1 等結合性較好，其中喬松素可降低NAFLD 大鼠INS 水平，且發揮一定的肝臟保護作用［19］；ALB 是一種主要在肝臟部位合成的結構蛋白，可作為肝臟纖維化程度及肝臟代償功能的評估指標［20］；Akt1 在胰島β 細胞增殖中的重要作用已被廣泛研究，且Akt1 在卵母細胞、原始卵泡膜細胞、顆粒細胞及黃體細胞中均有表達［21］。喬松素可能作為益腎消癥方中主要活性物質，通過調控胰島素抵抗途徑、調節卵巢生長及成熟來發揮治療多囊卵巢綜合征的作用。

綜上所述，益腎消癥方可能以“多成分-多靶點-多通路”的方式通過調控激素合成及胰島素抵抗來治療多囊卵巢綜合征，后續本課題組將對其活性成分及具體機制進行深入探討，以期為益腎消癥方在臨床治療中的辨證用藥提供科學依據。