基于網絡藥理學和生物信息學研究益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機制

鄒攀 程博 鐘文良伍永慧羅晶婧范婧瑩熊雨藺婷王賢文何迎春*

（1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙410208； 2.湖南省中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南 長沙410208； 3.中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208； 4.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

鼻咽癌是發生于鼻咽黏膜被覆上皮及小涎腺的惡性腫瘤［1］，世界衛生組織報告顯示2018 年新增鼻咽癌病例近13萬，死亡病例達7 萬余例［2］，流行病學研究［3］表明其可能與EB 病毒感染［4］、遺傳易感性［5］、有害環境因素的暴露［6］、特殊飲食習慣等因素有關。盡管鼻咽癌在我國南方地區為高發性疾病，但包括局部調強放療、化療［7］、分子靶向治療［8］、手術、免疫治療［9］等治療方法并沒有顯著改善患者的預后。因此，迫切需要尋求新的輔助治療方法，建立用于鼻咽癌生存風險預測的新生物標記或模型，以期為患者提供更有效和個性化的治療。

我國傳統醫學近年來成為綜合癌癥治療的選擇之一。正氣虧虛、氣虛染毒被認為是鼻咽癌的發生的內因，在鼻咽癌發生發展過程中，氣虛染毒既是始動環節，也是貫穿始終的基本病機，遂其基本治法為“益氣解毒”［10］。益氣解毒方是本課題組研究和應用了20 多年的經驗方，由黃連、黃芪、黨參、天花粉、茯苓、白花蛇舌草、甘草7 味中藥組成，以補益正氣的黃芪和清熱解毒的黃連作為君藥；黨參補益肺氣；白花蛇舌草清熱解毒、散癌祛毒；天花粉和茯苓相互配合，健脾養陰，充養其身，全方補瀉共用、氣陰雙補，共奏益氣解毒、平和抗毒之效，其在臨床應用多年并取得良好療效［11］。

中醫機制很難用現代醫學手段闡明，基于此，本研究將從網絡藥理學角度闡明益氣解毒方與鼻咽癌相關的基因、蛋白質和代謝物、作用通路之間的復雜相互作用關系，以揭示鼻咽癌發生和發展的潛在機制，并試圖闡述益氣解毒方防治鼻咽癌的分子機制，為促進人們對藥物機制的新理解提供新的視角。

1 材料

1.1 細胞株 人鼻咽癌細胞CNE2（低分化），購自北京北納創聯生物技術研究院，本實驗室傳代培養。

1.2 藥物 益氣解毒方組方藥材黃芪30 g、茯苓15 g、黨參15 g、天花粉10 g、黃連10 g、白花蛇舌草10 g、甘草6 g，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，水提物具體制備方法參考課題組前期研究［12］，所有飲片均由湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為正品，密封保存于-20 ℃下。注射用順鉑（美國Sigma 公司，批號P4394-25MG）。

1.3 試劑 RPMI 1640 培養基（美國Cytiva 公司，批號AF29546230）；胎牛血清（美 國 Gibco 公司，批號42A0378K）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國Sigma 公司，批號F4135、P3539）；PBS 緩沖液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WHO1111906XP）；DMSO（德國Biofroxx公司，批號EZ6789B103）；兔抗NF-κB、Cyclin D1、P21（批 號 4370S、2978T、2947T），鼠抗 β-actin（批 號2896T），山羊抗兔、抗小鼠二抗（批號7076P4、7074P2）（美國CST 公司）。

1.4 儀器 CO2培養箱（美國Forma 公司）；電泳儀、電泳槽、轉印槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；恒溫水浴箱（美國Pharmacia 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；ELX800 酶標儀（美國Bio-Tek公司）；雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；冷柜、冰箱、超低溫冰箱（美國Thermo Fisher 公司）；渦旋振蕩器（美國SBP 公司）。

2 方法

2.1 益氣解毒方有效成分篩選及靶點預測 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）是一個獨特的中草藥系統藥理學平臺，包括化學物質、靶點和藥物靶點網絡，涉及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug likeness，DL）、藥物相似度、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動力學（ADME）特性［13］。通過TCMSP 數據庫檢索益氣解毒方所含7 味中藥，即“黃連”“黃芪”“天花粉”“白花蛇舌草”“茯苓”“黨參”“甘草”，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件篩選化學成分［14］。

2.2 化學成分潛在作用靶標預測 通過TCMSP 數據庫，通過相關靶點（related targets）搜索功能欄進行檢索，獲得潛在藥物靶標，將潛在藥物靶標導入UniProtKB 數據庫（http：／ ／www.uniprot.org／）中進行靶點基因名稱校正，得到官方名稱（剔除非人源靶點），獲得藥物活性成分相關候選靶點。

2.3 益氣解毒方“活性成分-靶點”網絡構建 將益氣解毒方藥物活性成分、靶標導入Cytoscape3.6.0 軟件［15］中，應用Network Analyzer（網絡分析）計算網絡中節點參數，構建“活性成分-靶點”網絡以分析益氣解毒方中重要成分和靶點。

2.4 GEO 數據庫對鼻咽癌差異基因篩選 基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）是一個由基因表達數據、芯片和微陣列組成的公共功能基因組數據庫，以在GEO DataSets 數據庫中以“Nasopharyngeal carcinoma ”為關鍵詞，輸入類型為“Series”，研究類型為“Expression profiling by array”，研究對象為“Homo sapiens”，篩選獲得GPL6480 數據集，包含原發性鼻咽癌腫瘤樣品18例，非癌性鼻咽組織樣品 18例，下載 GPL6480-9577.txt 及GSE53819_series_ matrix.txt.gz 兩個文檔。使用R 軟件（版本3.4.1，http：／ ／www.r-project.org）的Bioconductor（http：／ ／www.bioconductor.org）軟件包進行數據處理和統計分析，利用Perl 語言將探針水平的表達數據轉換為基因符號水平數據，R 語言limma 軟件包［16］對鼻咽癌組織和非癌組織芯片數據的差異基因進行分析，對差異表達基因進行篩選，篩選條件設定為logFC＝1，Padj＝0.05。

2.5 活性成分-鼻咽癌靶標網絡構建 應用R 語言軟件venny.R 插件繪制益氣解毒方潛在藥物靶標與鼻咽癌差異表達基因靶點韋恩圖，Cytoscape 軟件構建“藥物-成分-靶點”網絡，Network analyzer 功能進行網絡特征分析，網絡中節點表示靶標或化合物，邊表示活性成分靶點與鼻咽癌靶標之間的相互作用關系，識別益氣解毒方中潛在的活性分子成分和靶點。

2.6 益氣解毒方治療鼻咽癌的PPI 網絡構建與關鍵靶點篩選 將益氣解毒方藥物作用靶標和 差異表達基因進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）關系網絡圖構建，采用cytoscape 中的BisoGenet 插件繪制其與鼻咽癌相關靶點的共同靶點PPI 互作網絡，抽取交集網絡，即得益氣解毒方治療鼻咽癌的直接和間接靶點調控網絡。通過網絡拓撲分析插件CytoNCA 進一步分析網絡中核心靶點，依次通過分析度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，篩選PPI 網絡中degree、betweenness 均超過所有節點中位數的節點，以節點傳遞信息量與傳遞效率［17］，作為后續研究的“關鍵靶標”［18］。為了探索差異表達基因的功能關聯，本研究還應用STRING 數據庫（https：／ ／string-db.org／）構建PPI 網絡，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將最高的置信度（0.4）作為最小的所需交互得分，其他參數保持默認設置，將PPI 網絡可視化。

2.7 基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析及網絡構建 應用R 語言軟件中clusterProfilerGO 軟件包及Perl 語言中的id2symbol 插件，對活性成分與鼻咽癌的共同靶點進行GO 分析（http：／ ／www.geneontology.org），其主要用于描述基因產物的功能，含有大量的基因注釋術語，包括細胞成分（CC）、分子功能（MF）、生物過程（BP）［19］；再應用R 語言中的clusterProfilerKEGG 軟件包進行KEGG 通路富集分析用于識別功能和代謝途徑，根據富集因子值分析核心通路富集程度以探索差異表達基因的生物學功能［20］，探究益氣解毒方治療鼻咽癌的可能生物功能及信號通路機制。

2.8 MTT 法檢測細胞活性 取對數生長期鼻咽癌CNE-2細胞，以4×104／mL 密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，待細胞貼壁后棄原培養基，分為對照組（空白培養基）、益氣解毒方組（2.0、1.0、0.5、0.25 g／L 益氣解毒方提取物）、順鉑組（4.0 mg／L 順鉑），每孔加入200 μL 含相應藥物的培養基，設6 個復孔，培養24、36、48 h 后棄原培養液，每孔加入50 μg／mL MTT 溶液100 μL，繼續孵育4 h 后于酶標儀檢測490 nm 波長處的吸光度值，實驗重復3 次。

2.9 Western blot 法檢測蛋白表達 取對數生長期CNE-2細胞，計數后取5×105個細胞接種至T25 培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，分為對照組（空白培養基）、益氣解毒方組（0.5、1.0 g／L 益氣解毒方提取物）、順鉑組（4 μmol／L 順鉑），加入相應藥物干預36 h，參考文獻［21］報道的方法進行蛋白定量、電泳、轉膜、掃膜，并分析信號值，檢測NF-κB、Cyclin D1、P21蛋白表達，實驗重復3 次。

2.10 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料數據均服從正態分布，以（）表示，單因素設計和多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 有效成分篩選及ADME 分析 采用TCMSP 數據庫，經OB、DL 等ADME 參數篩選得到有效成分黃連11種，黃芪13種，黨參17種，白花蛇舌草3種，茯苓6種，天花粉2種，甘草106種，共計131 種（對各藥物無效成分進行剔除）。通過相關靶點搜索功能欄獲得潛在藥物靶點2 417個，其中黃連287個，黃芪300個，黨參214個，白花蛇舌草71個，茯苓30個，天花粉5個，甘草1 510 個。

3.2 潛在作用靶點預測 通過TCMSP 數據庫收集131 種有效成分的2 417 個藥物靶點，打開UniprotKB 數據庫進行修正得到官方基因名。將活性成分、相關靶點蛋白名、官方基因名3 列數據統計于Excel 表格中，刪除重復項，得到2 082 條對應關系，將官方基因名單獨列出去后，得到潛在作用靶點239 個。

3.3 鼻咽癌相關疾病靶點 分析GEO 芯片數據庫中GPL6480 數據集，包含原發性鼻咽癌腫瘤樣品18例，非癌性鼻咽組織樣品18 例。通過R 語言limma 軟件包共鑒定出2 078 個差異表達基因，其中864 個（41.58%）上調，1 214 個（58.42%）下調，差異表達基因見圖1，圖1A 共列出40 個變化最為明顯的基因，可能與鼻咽癌致病密切相關。

圖1 癌與癌旁組織差異表達基因

3.4 “活性成分-靶點”網絡構建 應用R 語言軟件venny.R 插件將2 078 個差異表達基因與Uniprot 數據庫獲得的239 個益氣解毒方的潛在作用靶點繪制韋恩圖，共篩選出50 個共同靶點，見圖2。通過Cytoscape 軟件構建“藥物活性成分-鼻咽癌靶標”調控網絡，節點表示靶標或化合物，邊表示活性成分靶點與鼻咽癌靶標之間的相互作用，再通過Cytoscape 軟件構建 “藥物-成分-靶點”網絡，Network analyzer 功能進行網絡特征分析，見圖3。

圖2 益氣解毒方活性成分靶點與鼻咽癌疾病靶點韋恩圖

圖3 益氣解毒方活性成分-鼻咽癌靶點基因互作網絡

3.5 PPI 網絡構建與關鍵靶點篩選 采用Cytoscape 軟件的BisoGenet 工具包繪制益氣解毒方入血活性成分的靶點PPI網絡圖，發現直接或間接相關靶點1 872個，靶點間相互關系40 157個，再以CytoNCA 工具包抽取上述PPI 網絡圖的交集，設定DC 值＞61、BC 值＞600 進行網絡拓撲屬性篩選，發現關鍵蛋白404個，篩選出TOP 基因54個，見圖4。應用STRING 數據平臺輸入韋恩圖獲得的共同靶點名稱，選擇“high confidence：0.4”模式下構建的PPI 互作網絡，見圖5，節點表示蛋白，邊表示功能相關性。應用count.R 插件統計出現頻次前30 的蛋白靶點，發現較高者有VEGFA、JUN、IL1B、CCND1、ICAM1等，可能作為益氣解毒方治療鼻咽癌的潛在靶點，見圖6。

圖4 益氣解毒方關鍵節點的目標篩選策略

圖5 益氣解毒方共同靶點互作網絡（PPI）

圖6 益氣解毒方共同蛋白靶點出現頻次

3.6 生物功能（GO）分析通過R 語言軟件 “clusterProfiler”軟件包將50 個共同作用靶點進行GO 功能分析，按照生物學分類為分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）。由圖7 可知，差異表達基因的BP 主要集中在脂多糖反應、細菌起源分子反應、活性氧代謝過程、上皮細胞發育；MF 主要集中在細胞因子活性、細胞因子受體結合、受體配體活性、信號轉導受體激活劑、趨化因子受體結合、腫瘤壞死因子受體結合等；CC 主要集中在細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、線粒體外膜、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶復合物、細胞器外膜部分。

圖7 益氣解毒方共同作用靶點GO 功能分析柱狀圖

3.7 治療鼻咽癌核心通路篩選 采用R 語言軟件進行KEGG 富集分析，根據FDR＜0.01 篩選了20 條途徑，見圖8A，基于TNF 信號通路的潛在靶點見圖8B（紅色節點代表潛在靶點或與潛在靶點相關的酶及化合物），KEGG 與基因之間的關系網絡圖見圖8C，表明益氣解毒方治療鼻咽癌的機制是通過作用于多條信號通路、靶點、途徑來實現的。排除廣泛通路后，表1 中列出了富集靶點數目≥5 的信號通路，可知差異表達基因主要富集于IL-17、腫瘤壞死因子、NF-κB、Toll 樣受體信號通路中。

圖8 益氣解毒方治療鼻咽癌的信號通路

3.8 益氣解毒方對CNE2 細胞活性的影響 與對照組比較，不同質量濃度益氣解毒方水提物處理CNE2 細胞24、36、48 h后，細胞活性均受到抑制（P＜0.05），并呈劑量和時間依賴性，見圖9。

圖9 益氣解毒方對CNE2 細胞增殖的抑制作用

3.9 益氣解毒方對CNE2 細胞NF-κB、Cyclin D1、P21 蛋白表達的影響 根據Cytoscape 軟件分析可知，Cyclin D1（CCND1 基因的編碼產物）、P21（CDKN1A 基因編碼的蛋白）是益氣解毒方共同蛋白靶點，NFκB 是益氣解毒方治療鼻咽癌核心通路之一。如圖10 所示，與對照組比較，各劑量益氣解毒方組NF-κB、Cyclin D1、P21 蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 益氣解毒方對CNE2 細胞NFκB、Cyclin D1、P21 蛋白表達的抑制作用

4 討論

鼻咽癌的病理類型大部分為低分化和未分化，高度惡性且易轉移，目前尚無用于臨床的特異性分子標記物，因此，有必要闡明與腫瘤預后和侵襲性獨立相關的分子機制。隨著高通量測序技術和微陣列技術的迅猛發展，與鼻咽癌緊密相關的差異表達基因圖譜分析越來越多，為挖掘預防和治療鼻咽癌的潛在診療靶標提供新方法。本研究從GEO提取基因表達數據集，隨后進行了PPI 網絡分析、GO 分析、KEGG 途徑富集分析，以預測鼻咽癌進展的分子機制。

本研究共發現差異表達基因2 078個，并篩選出VEGFA、JUN、IL1B、CCND1、ICAM1 在內的差異表達中心基因。血管內皮生長因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，刺激腫瘤血管生成并驅動腫瘤的進展［22］；IL-1B 在原發腫瘤中的表達已被確定為預測乳腺癌患者［23］發生骨轉移風險增加的潛在生物標志物；CCND1即Cyclin D1，全稱G1／S-特異性周期蛋白-D1，其過表達導致有絲分裂異常繞過關鍵細胞檢查點致細胞快速生長并最終促進腫瘤生長［24］；ICAM-1 即細胞間黏附分子-1，是介導黏附反應重要的一個黏附分子，在控制腫瘤惡化和轉移以及調節機體免疫反應中起重要作用［25］。這些中心基因提示鼻咽癌的發生可能涉及腫瘤微環境的發生引起局部組織炎癥和免疫反應，導致基因突變發生細胞異常分裂，最終導致腫瘤發生。

益氣解毒方是本課題組田道法教授研發，經藥監部門批準以“益氣解毒顆粒”劑型作為醫院制劑的抗鼻咽癌中藥復方，在臨床療效確切。本實驗在前期研究基礎上，利用網絡藥理學和生物信息學研究益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機制，GO 分析表明，益氣解毒方治療鼻咽癌的關鍵靶點主要涉及活性氧代謝過程、上皮細胞發育、細胞因子活性、受體配體活性、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等生物過程。KEGG 通路分析表明，48 個共同靶點主要分布在TNF、IL-17、NF-κB 等信號通路，NF-κB 通常起調節細胞生長和炎癥作用［26］，在許多腫瘤過程中，細胞生長和增殖都需要NF-κB 信號傳導［27］，在鼻咽癌中LMP1［28］通過腫瘤壞死因子受體相關因子的結合激活NF-κB［29］；IL-17 細胞與其他免疫細胞相互作用改變腫瘤微環境［30］，IL-17 還可通過p38 絲裂原激活的蛋白激酶／NF-κB 信號通路促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲［31］。這些通路主要在細胞凋亡、增殖、侵襲轉移等方面發揮作用，預測益氣解毒方可能通過調控多個復雜的生物過程來治療鼻咽癌。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學和生物信息學初步挖掘、分析益氣解毒方多靶點防治鼻咽癌可能的作用機制，獲得了益氣解毒方的作用靶點和有效成分，預測并驗證了益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機制，為進一步驗證本課題組之前的實驗研究及后續深層次的藥效研究提供良好的基礎。