基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討精制冠心片治療冠心病的機(jī)制

陳敏 鄧萌萌伍蕊嗣周波韋袆潘曉鵑*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州646000； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都610041； 3.重慶市中藥研究所，重慶404100）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，常被稱為冠心?。?］。世界衛(wèi)生組織將冠心病分為無癥狀心肌缺血（隱匿性冠心?。?、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭和猝死5 種臨床類型［2］。冠心病的患病率在世界范圍內(nèi)不斷增加，也呈現(xiàn)出逐漸年輕化的狀態(tài)，其發(fā)病機(jī)制是體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，血管中脂質(zhì)沉淀在動(dòng)脈內(nèi)膜上，出現(xiàn)類似于粥樣的脂類物質(zhì)，聚集成白色斑塊，堵塞動(dòng)脈血管，血液流動(dòng)速度隨之降低，導(dǎo)致心臟缺血，最終演變成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。病變過程是內(nèi)皮細(xì)胞的改變，由線狀形逐漸變?yōu)閳A石塊形狀，使得單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞易于通過內(nèi)皮到達(dá)皮下間隙，驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［3］，同時(shí)脂蛋白水平增高，刺激低密度脂蛋白LDL 和其他脂蛋白聚集于病灶區(qū)，形成脂紋斑塊。血管內(nèi)膜增厚中膜變薄、血管外膜大量纖維化，逐漸形成纖維帽，繼而演變?yōu)槔w維斑塊［4-5］。

中醫(yī)認(rèn)為冠心病分為本虛和標(biāo)實(shí)2 種情況，通過辯證將這種疾病分為血瘀氣滯型、陰寒內(nèi)結(jié)型、痰濁閉阻型、痰瘀氣足型、心腎陰虛型、心脾兩虛型等［6］，按照類型的不同進(jìn)行相關(guān)的治療。治療標(biāo)實(shí)者可以單獨(dú)治其標(biāo)，補(bǔ)腎精者可重在標(biāo)本兼治，本虛者可以根據(jù)氣血陰陽虧虛不同采取相應(yīng)的治療方法［7-8］。鑒于中藥復(fù)方成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多等原因，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討中藥復(fù)方的生物活性成分及作用靶點(diǎn)，并應(yīng)用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵藥效成分和靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步闡明精制冠心片活性成分、作用機(jī)制以及發(fā)揮臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精制冠心片活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選 綜合文獻(xiàn)報(bào)道以及利用中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺(tái)（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分別輸入“丹參”“赤芍”“紅花”“降香”“川穹”5 味中藥藥名，查找活性成分，設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，收集符合條件的有效成分。綜合考慮該化學(xué)成分的含量及生物學(xué)效應(yīng)等多方面因素，最終確定為活性成分，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測其靶點(diǎn)蛋白。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）中將靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)基因名。

1.2 確定疾病靶點(diǎn) 通過OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.omim.org／）以 及 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.genecards.org／）搜集與冠心病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)庫中的疾病基因?qū)雃xcel 表格中合并數(shù)據(jù)，剔除重合基因條目，最終獲得冠心病相關(guān)基因。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將精制冠心片和冠心病共同作用靶點(diǎn)以gene symbol 形式上傳至STRING［9］（https：／ ／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，將物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“highest confidence”（＞0.9），隱藏游離蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行操作，將文件保存為TSV 格式。

1.4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過數(shù)據(jù)篩選獲得精制冠心片活性成分潛在作用靶點(diǎn)及冠心病疾病靶點(diǎn)，通過韋恩圖取交集得到2 者共同靶點(diǎn)112個(gè)，利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-成分-基因靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，藥物活性成分和作用靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

1.5 基因本體（GO）富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）對精制冠心片和冠心病共同作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，篩選P＜0.05 的前20個(gè)條目，借助 omicshare網(wǎng)站（https：／ ／www.omicshare.com／）進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，以闡釋精制冠心片治療冠心病的生物功能及相關(guān)信號通路，結(jié)果以柱形圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.6 分子對接驗(yàn)證 從PDB 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／）中下載核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用PyMol 2.3.4 軟件對核心蛋白進(jìn)行去水、分離原配體等操作，保存后導(dǎo)入Autodock 4.2.6 軟件加氫、設(shè)置原子類型，保存為“pdbqt”格式。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載小分子結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”結(jié)構(gòu)，利用Autodock 進(jìn)行核心成分的分子對接。結(jié)合能代表受體與配體之間的作用力，結(jié)合能越低，氫鍵數(shù)目越多，構(gòu)象越穩(wěn)定，其能量越低，相互作用的可能性就越大［10］。通常認(rèn)為，結(jié)合能絕對值大于4.25 kJ／mol 代表配體與受體之間有一定的結(jié)合力；大于5.0 kJ／mol 表示有較好的結(jié)合活性；大于7 kJ／mol 表明結(jié)合活性強(qiáng)烈。

2 結(jié)果

2.1 精制冠心片活性成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 進(jìn)行篩選，剔除無對應(yīng)靶點(diǎn)成分，得到丹參、赤芍、紅花、降香、川穹的有效化合物160個(gè)，其中丹參65個(gè)，赤芍29個(gè)，紅花22個(gè)，降香37個(gè)，川芎7個(gè)，有效化合物信息如表1 所示。

表1 精制冠心片候選化合物

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 冠心病疾病靶點(diǎn)篩選 在疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（OMIM 和GeneCards）查找檢索冠心病的疾病作用靶點(diǎn)，挖掘并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共收集到潛在疾病靶點(diǎn)1 368個(gè)，將得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名和Uniprot ID 的標(biāo)準(zhǔn)化。利用韋恩圖獲得精制冠心片和冠心病兩者的共同作用靶點(diǎn)112 個(gè)。由圖1 可知，精制冠心片可以通過多種成分作用于冠心病疾病的多個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)來發(fā)揮抗冠心病的作用。

圖1 “藥物-疾病”交集靶基因韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建精制冠心片治療冠心病潛在靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果見圖2，共有節(jié)點(diǎn)60個(gè)，邊數(shù)233條，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為7.77，平均局部聚類系數(shù)為0.557。

圖2 精制冠心片治療冠心病的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 中藥—成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析結(jié)果 將精制冠心片活性成分和作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共包含360 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 006條邊（圖3）。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)，度值越大則表明該化合物發(fā)揮作用的可能性越大，各節(jié)點(diǎn)根據(jù)degree 值呈現(xiàn)為不同大小。菱形代表基因靶點(diǎn)，圓形代表各中藥成分，正六邊形代表各中藥所共有的靶點(diǎn)。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹梢缘贸?，該網(wǎng)絡(luò)中，度值大于等于50（中位數(shù)）的化合物有13個(gè)，包括6-羥基山柰酚（degree ＝69）、川芎哚（degree ＝102）、柳杉酚（degree＝56）、黃檀素（degree ＝65）、楊梅酮（degree ＝78）、丹參酮ⅡA（degree ＝109）、芍藥苷（degree＝77）、隱丹參酮（degree ＝89）、丹參酮Ⅰ（degree ＝91）、山柰素（degree ＝53）等，因此可以推測上述成分可能是精制冠心片治療冠心病的重要成分。

圖3 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫，對精制冠心片和冠心病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，得到20 個(gè)生物過程、88 個(gè)細(xì)胞組分、167 個(gè)分子功能。富集結(jié)果表明，精制冠心片治療冠心病的生物過程主要與細(xì)胞內(nèi)信號的正向轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞群的增殖、細(xì)胞的積極代謝、細(xì)胞對化學(xué)、壓力、藥物刺激、含氧化合物等的反應(yīng)有關(guān)（圖4A）；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、小窩、內(nèi)膜系統(tǒng)、囊泡、質(zhì)膜、核染色質(zhì)、肌膜炎、空泡、溶酶體、Z 盤等（圖4B）；分子功能主要集中于蛋白質(zhì)二聚活性、細(xì)胞因子活性、脂質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號受體活性、過氧化物酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、花生四烯酸結(jié)合、NFAT 蛋白結(jié)合、胰島素樣生長因子Ⅱ結(jié)合（圖4C）。分析結(jié)果顯示，冠心病涉及體內(nèi)多個(gè)生物學(xué)過程，精制冠心片可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程起到治療冠心病的作用。

圖4 GO 富集結(jié)果柱形圖

2.6 KEGG 通路富集分析 對精制冠心片和冠心病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果以P＜0.05 篩選，共有119 條信號通路出現(xiàn)富集，以Count 值降序篩選排名前20的KEGG 通路輸出氣泡圖（圖5）。其中節(jié)點(diǎn)的大小表示富集到的靶點(diǎn)數(shù)量，節(jié)點(diǎn)的顏色由紅色至藍(lán)色表明P值由大到小。因此，紅色節(jié)點(diǎn)越大信號通路的顯著性就越高，說明該信號通路的重要性越高，排除廣泛通路后，表2 中列出了排名前20 的信號通路。經(jīng)分析，主要分布于腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1 信號通路、Toll 樣受體信號通路、VEGF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、MAPK 信號通路等通路中。

表2 KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中Degree 值前20 的靶標(biāo)

圖5 KEGG 通路富集分析結(jié)果

2.7 分子對接驗(yàn)證 如表3 所示，4 個(gè)成分的結(jié)合力均小于0，說明其與靶點(diǎn)產(chǎn)生自發(fā)性結(jié)合。芍藥苷與ADRB2 靶點(diǎn)結(jié)合能為-8.0 kJ／mol，氫鍵數(shù)目為3；丹參酮ⅡA與ADRB2 的結(jié)合能最大為-9.6 kJ／mol，氫鍵數(shù)目為1。對接結(jié)果表明，精制冠心片中關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能力低，相互之間結(jié)合性好生物活性高，是精制冠心片治療冠心病的關(guān)鍵，見圖6。

圖6 蛋白對接構(gòu)象

表3 核心成分與靶點(diǎn)的結(jié)合情況

3 討論

本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法挖掘精制冠心片的有效入血成分，對冠心病的作用靶點(diǎn)及涉及的通路進(jìn)行研究。從靶點(diǎn)、信號通路的角度闡釋精制冠心片治療冠心病的作用機(jī)制，以及利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證了主要活性成分與核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合作用。構(gòu)建精制冠心片治療冠心病的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”交互網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出精制冠心片的165 個(gè)活性成分及112 個(gè)與疾病共同的作用靶點(diǎn)，使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龇椒êY選出13 個(gè)顯著有效化合物。GO 富集和KEGG 富集顯示涉及20 個(gè)生物過程，88 個(gè)細(xì)胞組分、167 個(gè)分子功能，119 條信號通路。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及分子對接驗(yàn)證，得到精制冠心片治療冠心病關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的核心靶點(diǎn)是PTGS2、NCOA2、ADRB2 等。上述靶點(diǎn)與炎癥調(diào)節(jié)、體內(nèi)凝血系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝系統(tǒng)等密切相關(guān)。GO 富集分析顯示，精制冠心片治療冠心病與G 蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素受體等有關(guān)。KEGG 通路富集分析顯示，精制冠心片對冠心病的治療涉及IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路［11-12］、HIF-1 信號通路等。

丹參中的有效化合物丹參酮ⅡA具有抗凝血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂等作用［13-14］。川芎中的川芎嗪可改善冠狀動(dòng)脈的血液循環(huán)，減輕缺血所引起的心肌細(xì)胞損傷，抑制血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的溢出，減小缺血范圍，促進(jìn)纖維蛋白降解，對抗體外血漿凝血，從而達(dá)到治療冠心病的目的［15-16］。紅花中的主要活性成分山柰素具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化，增加冠狀動(dòng)脈血流量和降低冠狀動(dòng)脈阻力等作用，還能抑制動(dòng)脈粥樣硬化血管中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，阻止內(nèi)皮細(xì)胞過度增生，穩(wěn)定血管內(nèi)膜等作用［17-18］。赤芍的主要化合物具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量，抑制血小板聚集等作用［19-20］。研究顯示，川芎和赤芍合用或單用均可降低血清中TC、TG、LDL 水平，合用可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低丙二醛（MDA）水平，在提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力及促進(jìn)NO 釋放方面產(chǎn)生協(xié)同作用［21］。降香的主要化學(xué)成分包含揮發(fā)油類和黃酮類化合物，具有舒張血管、增加冠脈血流、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［22-23］。

綜上所述，精制冠心片中的丹參酮ⅡA、芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、6-羥基山柰酚、川芎哚、柳杉酚等有效化合物可能通過HIF-1、Toll 樣受體、VEGF、NOD 樣受體、T 細(xì)胞受體等信號通路作用于PTGS2、PTGS1、NCOA2、ADRB2 等靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)預(yù)測結(jié)果與已有文獻(xiàn)結(jié)果較為相近，體現(xiàn)了此方法具有一定的準(zhǔn)確性，同時(shí)契合中藥整體觀、系統(tǒng)性的理念，為進(jìn)一步闡述精制冠心片治療冠心病提供參考。