基于分子對接的玉屏風中端粒酶TERT 激動劑的虛擬篩選

湯建朱銳靈趙康琦夏海平聞崇煒

（1.亳州學院中藥學院，安徽 亳州236800； 2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江212013； 3.江蘇大學附屬四院神經內科，江蘇 鎮江212001）

玉屏風系中醫扶正固本的經典名方，由黃芪、白術和防風組成，諸藥合參，藥簡效宏［1］，具有抗衰老的可能性［1-2］。玉屏風能明顯地延長果蠅的平均壽命，對BJ 細胞中的端粒酶有較好的激活作用，其抗衰老作用可能與端粒酶激活有關［3］。玉屏風中化學成分繁雜，關鍵活性成分和激活端粒酶的機制尚不明確。

端粒酶是端粒復制所必須的一種特殊的DNA 聚合酶，若激活端粒酶，可增加細胞分裂次數，從而延長細胞壽命［4-5］。端粒酶逆轉錄酶（TERT）是端粒酶的限速亞單位，是端粒酶活性調節的關鍵基因，針對TERT 的活性成分篩選是發現端粒酶激動劑（抗衰老）或抑制劑（抗癌）的有效方法［6-7］。目前靶向端粒酶或TERT 的研究以篩選端粒酶抑制劑居多［7］，而激動劑的研究較少，環黃芪醇是目前唯一被公認的通過激活端粒酶發揮抗衰老作用的天然膳食補充劑［5-6］。為發現更多潛在的抗衰老活性化合物，以端粒酶TERT 基因為靶蛋白，采用分子對接技術從傳統中藥玉屏風中虛擬篩選激動TERT 的活性成分。

分子對接是利用計算機軟件模擬小分子配體與大分子受體之間活性位點的最佳結合模式的技術，在中藥活性成分篩選和靶點確證方面有著廣泛的應用前景［8-9］，與網絡藥理學聯用在中藥多組分、多途徑發揮藥效的解析工作中發揮了重要作用［10］。本研究采用AutoDock Vina 軟件［11］，將檢索到的玉屏風中的小分子化合物與端粒酶TERT 基因進行分子對接，根據打分虛擬篩選出潛在的端粒酶激活劑，為闡明玉屏風的抗衰老活性機制提供科學依據。

1 材料

采用ChemOffice2020 程序（美國PerkinElmer 公司）中的ChemDraw 和Chem 3D模塊、AutoDock Tools1.5.6 和AutoDock Vina（斯克利普斯研究所）、Pymol 1.8（美國DeLano Scientific LLC公司）和Discovery Studio 2017R2 client（美國BIOVIA 公司）。

2 方法

2.1 靶蛋白TERT 結構的獲取和預處理 通過檢索搜索PDB 結構數據庫（http：／ ／www.rcsb.org／pdb／home／home.do），獲取靶點蛋白TERT 復合物（PDB ID：5CQG），將靶點蛋白依次導入AutoDock Tools1.5.6中，刪除原配體BIBR1532，水分子，加氫，保存為pdbqt 格式，以備分子對接。

2.2 化合物（配體）庫的建立 通過檢索PubChem 等數據庫［12］和相關文獻，從玉屏風的水煎劑以及3 種原藥材黃芪、白術和防風中共收集68 個化合物（配體），主要為三萜皂苷、黃酮、白術內酯、色原酮、香豆素等化合物，見表1，ChemDraw 軟件繪制分子結構，并用Chem3D 轉化成三維結構，MM2 力場進行最小能量優化，結果保存為mol2格式。AutoDock Tools1.5.6 對小分子進行加氫，計算Gasteiger 電荷，合并非極性氫，最終保存為pdbqt 格式，以備分子對接。

表1 玉屏風中68 個小分子化合物

2.3 配體-靶蛋白的分子對接 在對接前，須確定驗證對接過程中參數設置的合理性。首先用AutoDock Tools 1.5.6軟件將靶點蛋白晶體復合物中的原配體取出，利用AutoDock Vina 與受體重新對接，其結合能打分值為閾值，同時分析對接構象和原蛋白晶體結構中的構象的重疊度，通常認為均方根偏差（RMSD）在2? 范圍內。

分子對接的晶格中心設置為x＝24.667，y＝6.99，z＝-31.485（nm），對接空間（Grid Box）：30 nm×30 nm×30 nm，能量范圍為4。利用Vina 軟件進行半柔性對接（對接過程中受體是剛性，配體是柔性，可在一定范圍內變化），得到配體分子與靶點蛋白（PDB ID：5CQG）對接后的能量打分值。

3 結果

通過分子對接，均選擇序號1 的打分值（dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均為0），見表2。發現68個化合物的對接分值與結構有明顯的相關性。其中異黃酮類（20～25）以及異黃烷醇類（26～27）等化合物具有最強的結合力（≥-9.0 kcal／mol）；色原酮類化合物（41～52）具有較強的結合力（-8.1～-9.1 kcal／mol）；大部分白術內酯類和香豆素類具有中等強度的結合力，但雙白術內酯（39）和雙表白術內酯（40）與TERT 的結合力較強，分值為-9.2、-9.9 kcal／mol。紫花前胡苷元（63）和異紫花前胡苷（64）也表現出較高的結合力，分值分別為-9.0、-9.5 kcal／mol；黃芪皂苷類化合物（1～19）結合力普遍偏弱，大部分黃芪皂苷物質的分值在-7.0～-7.4 kcal／mol。所有化合物與TERT 的對接分值均低于原配體BIBR1532（-10.7 kcal／mol）。

表2 化合物與受體蛋白TERT 的結合能（kcal／mol）

玉屏風68 個化合物中，打分值最高的是毛蕊異黃酮苷（20）和芒柄花苷（22）。3D 圖顯示毛蕊異黃酮苷的分子卡在蛋白5CQG 的凹槽內（圖1A）。2D 圖中可見化合物與殘基GLY553、PHE478 和TRP498 形成范德華力；糖片段的3-OH 與殘基ARG557、GLY495 形成氫鍵；黃酮苷元的A、C 環與殘基MET482 之間，B 環與殘基MET483 之間形成π-硫鍵；A、C 環與殘基TYR551 之間，A、B、C 環與殘基PHE494 之間形成π-π 鍵；分子還與殘基LEU554、ILE497和ILE550 形成π-烷基鍵（圖1B）。圖1C 顯示，芒柄花苷的分子與蛋白5CQG 有著類似的結合方式，芒柄花苷與殘基PHE478、GLY495、ARG557 和GLY553 形成范德華力；糖片段的3-OH 與殘基TRP498 形成氫鍵；黃酮苷元的A、C 環與殘基MET482 之間，B 環與殘基MET483 之間形成π-硫鍵；A、C 環與殘基TYR551 之間，A、B、C 環與殘基PHE494 之間形成π-π 鍵；分子還與殘基ILE497、LEU554和ILE550 形成π-烷基鍵（圖1D）。毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷與蛋白的結合緊密，存在著作用明顯的作用力，這也很好地解釋了這兩個化合物與TERT 的結合力最強的原因。

圖1 毛蕊異黃酮苷（A、B）和芒柄花苷（C、D）與TERT（5CQG）的對接示意圖

4 討論

玉屏風為扶正固本經典名方，對機體的免疫功能具有雙向調節作用，在抗疲勞、抗衰老等方面均具有良好的應用前景。原藥材黃芪的主要活性成分為皂苷、黃酮和多糖；白術的化學成分主要是揮發油、內酯類化合物、苷類化合物以及多糖；防風的化學成分主要為色原酮類化合物、香豆素、揮發油、聚炔和多糖等。雖然通過色譜手段分離鑒定了大量的天然小分子化合物，其中白術中分離得到的倍半萜類化合物就有100 多種，但玉屏風的水煎劑中通過LCMS 等手段，僅僅發現了10 余種成分，其中白術藥材中只有3 種成分進入水煎劑。以玉屏風水煎劑中的15 個化合物為主要成分，經適當擴充，選擇了68 種小分子化合物進行研究，其中30 種源于黃芪，10 種源于白術，28 種源于防風。雖然多糖成分具有良好的免疫增強等活性，但其化學結構尚不能確定，不適合進行分子對接［9］。目前PDB 數據庫中還未收錄人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）的結晶結構，因此以高度近似的昆蟲赤擬谷盜（Tribolium castaneum）TERT 基因為模板進行分子對接［7］。又因目前尚無TERT 基因與其激活劑的結晶復合物，故本文中使用赤擬谷盜TERT基因與抑制劑BIBR1532 結晶復合物（PDB ID：5CQG）作為對接蛋白［7，13］。

68 個化合物中，有些化合物與TERT 對接打分值和實驗藥理活性的差距較大。環黃芪醇能夠明顯地增加TERT表達而激活端粒酶［5-6］。前期篩選端粒酶激活劑研究中發現，黃芪甲苷具有溫和的激活端粒酶的活性，能促進BJ 細胞生長，只是弱于其苷元環黃芪醇。但本文中環黃芪醇與TERT 對接的分值為-7.7 kcal／mol，其糖苷化合物（黃芪甲苷）的對接分值僅為-7.1 kcal／mol，屬中等強度。人參炔醇和法卡林二醇在細胞模型中均表現出良好的細胞毒活性［14-15］，推測其與TERT 可能有較高的結合力，但分子對接結合力較弱，分值僅為-6.8、-5.9 kcal／mol。

對接的分值較高，說明化合物與TERT 的結合力較強，但不能確定是激活劑還是抑制劑。如毛蕊異黃酮的結合力為-10.2 kcal／mol，但實驗證明，該物質既有良好的抗腫瘤活性，又有顯著的抗衰老活性［16］。藥效的表達不是簡單的抑制或激活，而是一個復雜的調節過程。

綜上所述，玉屏風具有良好的激活端粒酶能力，在抗衰老等方面具有良好的應用潛力，其活性物質可能通過TERT 激活端粒酶。分子對接只能預測化合物與靶酶TERT的結合力，但這些化合物是激動劑還是抑制劑還需要細胞或動物實驗確證。