絕經期復發性尿路感染患者腸道菌群特征及濯淋顆粒的干預作用

朱美鳳朱鶯王身菊張玲萬冰瑩陳岱*周春祥

（1.南京中醫藥大學常州附屬醫院，江蘇 常州213003； 2.南京中醫藥大學常熟附屬醫院，江蘇 常熟215500； 3.南京中醫藥大學，江蘇 南京210046）

復發性尿路感染是指半年內發作≥2次，或1 年內發作≥3 次的尿路感染，具有反復發作、難以根治的特點。絕經期女性隨著年齡的增長，泌尿生殖系統逐漸發生退行性變和功能減退，發生復發性尿路感染的風險增加［1-2］。抗菌藥物預防已被證明在降低女性復發性尿路感染的風險方面有效，但會誘導致病微生物和本地菌群產生耐藥性［2］。

研究發現，腸源性細菌上行是發生尿路感染的始動因素［3-5］。Ghalavand等［3］從63 名癥狀性尿路感染患者的糞便和尿液樣本中分離出糞腸球菌，RAPD-PCR、PFGE 分析顯示分別有26.9%、15.8%的同一個體成對糞腸球菌之間的分子指紋圖譜模式相同，證實了腸道內定植細菌污染引起的內源性感染；Magruder等［4］報道，1%腸道大腸桿菌和腸球菌相對豐度是發生腸桿菌尿路感染和腸球菌尿路感染的獨立危險因素，提出了“腸道菌群-UTI 軸”的觀念。腸道菌群失衡可能與絕經期女性發生復發性尿路感染的風險相關，但目前尚無揭示絕經期復發性尿路感染患者的腸道菌群特征的報道。

濯淋顆粒是南京中醫藥大學常州附屬醫院張志堅教授臨床經驗方，具有解郁濯淋的功效，對絕經期復發性尿路感染療效確切，能提高肝郁濕熱證復發性尿路感染患者治愈率，改善臨床癥狀，降低復發率［6］。為此，本研究在前期報道基礎上，進一步觀察絕經期復發性尿路感染患者腸道菌群特征，以及濯淋顆粒的干預作用，以期從腸道微生態角度探討濯淋顆粒防治復發性尿路感染的機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2019 年1 月6 月南京中醫藥大學常州附屬醫院腎病科門診治療的16 例絕經期復發性尿路感染患者，隨機分為中藥組、西藥組，每組8例，同期本院健康體檢人群8 例為健康對照組。研究經南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院倫理委員會批準［批件號2018-LL-02（L）］。

1.2 診斷、納入、排除標準

1.2.1 診斷標準 參照《尿路感染診斷與治療中國專家共識（2015 版）——尿路感染抗菌藥物選擇策略及特殊類型尿路感染的治療建議》［7］制定，即尿路感染（尿頻、急、痛中至少存在2 個癥狀，中段尿培養菌落計數≥1.0×105cfu／mL）6 個月內發作≥2次，或1 年內發作≥3 次。

1.2.2 納入標準 ①年齡45～80 周歲，女性；②生理性絕經1 年以上；③符合“1.2.1”項下診斷標準；④近3 個月內未使用抗生素、微生態制劑；⑤自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2.3 排除標準 ①復雜性尿路感染；②由真菌、支原體、衣原體、寄生蟲等引起的尿路感染；③合并嚴重心、肝、腎、造血系統、呼吸系統、內分泌系統等疾病，以及惡性腫瘤或影響其生存的嚴重疾病；④精神不健全；⑤3個月內使用過抗生素、微生態制劑；⑥對本研究藥物過敏；⑦正在參加其他臨床研究。

1.3 治療方法 中藥組口服濯淋顆粒，由烏藥10 g、青皮10 g、木香10 g、川楝子10 g、柴胡10 g、炒梔子10 g、滑石10 g、車前草15 g、瞿麥10 g、赤芍10 g、川斷10 g、桑寄生10 g、甘草3 g 組成，每天1劑，共400 mL，分早、晚2 次開水沖服；西藥組根據中段尿培養藥敏試驗結果，選用敏感抗生素口服，包括左氧氟沙星膠囊（揚子江藥業有限公司，國藥準字H19990051）、頭孢丙烯（揚子江藥業有限公司，國藥準字H20061246）、呋喃妥因腸溶片（常州康普藥業有限公司，國藥準字H32021349）、法羅培南（魯南貝特制藥有限公司，國藥準字H20060977），常規劑量口服2 周后，改為每晚1粒，2 組患者均連續治療4 周。治療前后，檢測患者血常規、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐，進行安全性評價。

1.4 標本采集 復發性尿路感染組［治療前0～2 d、治療（28±2）d］、健康對照組（入組后）采集糞便標本。患者排空小便后，準備好便盆和糞便采集管，洗手，帶上手套收集新鮮的糞便標本200～500 mg，放入無菌EP管，做好標記，標本采集后置于4 ℃冰盒中，30 min 內運回實驗室，置于-80 ℃冰箱中凍存待用。采集、運送樣本過程嚴格按照無菌操作規范進行。

1.5 糞便DNA 提取、擴增及測序 采用E.Z.N.A.糞便DNA 試劑盒（美國Omega Biotek 公司）對樣本基因組DNA 進行提取。選擇16 S rDNA 的V3～V4 高變區作擴增和測序目的片段，引物序列為 341F（正 向）CCTACGGGNGGCWGCAG，806R（反 向）GGACTACHVGG GTATCTAAT。PCR 反應體系為50 μL 混合物，包括100 ng模板DNA、1 μL KOD 聚合酶、5 μL 10×OD緩沖液、5 μL 2.5 mmol／L dNTPs、1.5 μL 引物（每種5 μL）；PCR 反應條件為95 ℃預變性2 min，98 ℃10 s，62 ℃30 s，68 ℃30 s，27個循環，68 ℃ 10 min。PCR 擴增產物切膠回收，用QuantiFluor TM 熒光劑進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機測序，純化和定量后對PCR 產物進行測序，對照Silva數據庫進行物種注釋和分類。文庫構建與測序工作由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用KW 秩和檢驗，R 語言繪制物種累積曲線。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 復發性尿路感染組、健康對照組年齡、BMI、絕經年限，以及中藥組、西藥組年齡、BMI、絕經年限、既往尿路感染發作次數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療4 周后，中藥組5 例、西藥組4 例完成糞便采集。見表1～2。

表1 復發性尿路感染組、健康對照組一般資料比較（）

表1 復發性尿路感染組、健康對照組一般資料比較（）

表2 中藥組、西藥組一般資料比較（， n＝8）

表2 中藥組、西藥組一般資料比較（， n＝8）

2.2 物種累積曲線分析 經OTUs 聚類后，從糞便樣品中隨機抽取一定測序量的數據構建物種累積曲線以評估抽樣是否充分和糞便樣品的豐富度。結果顯示，33 個糞便樣本的曲線急劇上升后趨于平緩，表明抽樣充分，擴大樣本量不會增加新物種，見圖1。

圖1 糞便樣本物種累積曲線

2.3 OTU 分析 復發性尿路感染組、健康對照組共有OTUs 為499個，前者OTU 數目少于后者（672個vs858個），見圖2。OTU 主成分分析顯示，PC1 值為29.00%，PC2 值為11.92%，健康對照組糞便樣品在PCA 圖中的分布相對集中，而復發性尿路感染組相對分散，前者相似度高于后者，見圖3。

圖2 腸道菌群Venn圖

圖3 腸道菌群PCA圖

2.4 腸道菌群多樣性分析 復發性尿路感染組腸道菌群的sobs 指數低于健康對照組（702.187 5vs823.875 0）（P＜0.05），提示復發性尿路感染患者腸道菌群α 多樣性降低，見圖4。同時，PCo1、PCo2 分別為31.98%、14.19%，復發性尿路感染組、健康對照組在PCoA 圖上各自聚類，又有部分重疊，2 類人群腸道菌群β 多樣性存在顯著差異（P＜0.01），見圖5。

圖4 腸道菌群sobs 指數

圖5 腸道菌群PCoA圖

2.5 腸道菌群結構變化 見圖6～8、表3。在門分類水平上，①健康對照組主要優勢菌門為厚壁菌門＞擬桿菌門＞疣微菌門＞變形菌門，而復發性尿路感染組主要優勢菌門為擬桿菌門＞厚壁菌門＞變形菌門＞放線菌門，后者擬桿菌門豐度高于前者（P＜0.05），厚壁菌門豐度、厚壁菌門與擬桿菌門比值（F／B）、疣微菌門豐度更低（P＜0.05）；②治療后，中藥組擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門豐度及F／B 升高，而西藥組擬桿菌門、疣微菌門豐度上升，厚壁菌門、變形菌門豐度及F／B 下降；③治療后，2 組腸道菌群相對豐度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 中藥組、西藥組、健康對照組腸道菌群相對豐度比較（%）

圖6 腸道菌群在門水平上分布

圖7 腸道菌群在屬水平上分布

圖8 各組腸道樣品OTU 分布的Venn圖

在屬分類水平上，①健康對照組主要優勢菌屬為擬桿菌屬＞Akkermansia＞Phascolarctobacterium＞Dialister，而復發性尿路感染組主要優勢菌屬為擬桿菌屬＞罕見小球菌屬（Subdoligranulum）＞大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）＞Phascolarctobacterium，后者擬桿菌屬豐度高于前者（P＜0.05），Akkermansia、另枝菌屬（Alistipes）、Dialister、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬豐度更低（P＜0.05）；②治療后，中藥組擬桿菌屬、罕見小球菌屬豐度下降，乳桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌屬豐度上升，而西藥組罕見小球菌屬、乳桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌屬豐度下降；③治療后，2 組腸道菌群相對豐度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

復發性尿路感染屬于中醫“淋證”范疇，臨床證候與肝經密切相關。《靈樞·經脈》云“是主肝所生病者……遺溺閉癃”。絕經期復發性尿路感染，或因郁致病，或因病致郁，兩者互為因果［8］。情志失和，肝失其用，疏泄失職，氣滯濕阻，溲溺約利失節；濕熱之邪循經下注，濕熱、郁熱膠著，淋證纏綿難愈。近年來多項研究報道，糞便移植可以降低復發性尿路感染的復發率。因此，調節腸道菌群可能是中醫藥防治絕經期復發性尿路感染的新策略［9-12］。

濯淋顆粒功能解郁、濯淋，在臨床治療絕經期復發性尿路感染取得了良好療效［6］。方中烏藥入厥陰肝經，行氣止痛、溫腎散寒，木香性溫、味辛苦，功可行氣止痛，又可理氣健脾；《婦人良方》 云“若肝經氣滯，用四君、青皮柴胡”，青皮味苦辛，色清氣烈，主氣滯、破積結，入肝散結，柴胡味苦辛，歸肝經，疏肝理氣，以柴胡、青皮疏化而利。川楝子苦寒清熱，長于疏肝止痛，梔子性寒、味苦，瀉火除煩、清熱利尿，滑石味甘淡、性平，利尿通淋，車前草、瞿麥具有清熱解毒、利尿；赤芍味苦，性微寒，歸肝經，具有活血行氣、化瘀通絡；絕經期女性，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，腎精虧虛，加入川斷、桑寄生以補腎，扶正以祛邪。甘草味甘性平，能調和諸藥。諸藥合用扶正祛邪兼施。現代藥理已經證明，梔子對腸桿菌、腸球菌有較強的抑制作用［13］；車前草種子多糖可以提升小鼠結腸菌群多樣性，擬桿菌屬、真桿菌屬、Butyrivibrio sp.、雙歧桿菌、發酵乳桿菌屬、羅伊氏乳桿菌屬豐度［14］；甘草總皂苷可以提高肝損傷大鼠腸道菌群乳桿菌屬的相對豐度［15］。

本研究通過對16 例絕經期復發性尿路感染患者和8 例健康對照者進行腸道細菌16 S rDNA 的V3～V4 可變區擴增、測序。結果表明，復發性尿路感染組腸道菌群的多樣性低于健康對照組，乳桿菌屬豐度低于健康對照組，兩組腸道菌群結構存在差異。濯淋顆粒可以調節厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門的相對豐度，提高F／B 比值，表明濯淋顆粒可以重建腸道菌群平衡。濯淋顆粒治療后乳桿菌屬相對豐度增加，表明濯淋顆粒干預可能增加乳桿菌屬的豐度，對腸道菌群產生了積極效應。就條件致病菌而言，濯淋顆粒治療4 周后，變形桿菌、大腸桿菌-志賀菌屬較治療前增加但沒有統計學意義，表明濯淋顆粒對條件致病菌影響較小。而抗生素組治療后乳桿菌屬豐度下降。

抗生素治療尿路感染強調殺滅病原菌，會引起腸道菌群紊亂，反而導致感染的風險增加。濯淋顆粒可以增加腸道有益菌，重新建立腸道微生態平衡，體現了中醫“陰平陽秘”的核心思想。本研究中藥組、西藥組在治療后腸道菌群差異比較無統計學意義，考慮與觀察周期短有關。

本研究初步研究了絕經期復發性尿路感染女性患者的腸道菌群特征，并初步探討了濯淋顆粒對腸道菌群的影響，推測濯淋顆粒可以重建腸道菌群平衡。但因條件限制，本研究是一項基于少數樣本的研究，且設計粗淺，有待進一步深入研究與驗證。