向日葵HaLACS1的克隆、表達及酵母功能互補鑒定

楊佳寶 周至銘 張展 馮麗 孫黎

（1. 石河子大學生命科學學院，石河子 832003；2. 兵團興新職業技術學院，巴州 841007）

向日葵（Helianthus annuus L.）是我國四大油料作物之一，主要種植在內蒙古、新疆、甘肅等北方地區，種植面積約100萬hm2，總產約200萬t［1］。傳統葵花籽油中含有大量的不飽和脂肪酸，主要為油酸（14%-43%）和亞油酸（44%-75%），約占總脂肪酸含量的85%［2］，是最健康的食用植物油之一，而且向日葵耐鹽堿、抗旱、耐瘠薄，被譽為“鹽堿地的先鋒作物”［3］，在生態環境保護和地方經濟可持續發展中具有不可替代的重要作用。

植物油主要以三酰甘油（triacylglycerol，TAG）形式儲存在成熟種子中，為種子萌發和幼苗生長提供能量［4］。在TAG合成與分解代謝過程中，長鏈脂酰CoA合成酶（long chain acyl-CoA synthetase，LACS）是極為重要的一類酶，它可催化游離脂肪酸生成脂酰CoA，這是其他脂代謝酶利用脂肪酸所必需的關鍵步驟［5-6］。LACS的催化作用主要分為兩步：首先游離脂肪酸和ATP反應形成中間體，然后中間反應產物與CoA的硫酯鍵反應形成脂酰CoA［6-8］。形成的脂酰CoA可進入β-氧化途徑，參與脂肪酸的降解過程［7］，也可作為TAG合成的前體物質發揮 作用［5］。

LACS廣泛存在于哺乳動物、植物、酵母以及大腸桿菌等生物體中，在生物油脂合成及分解代謝中發揮著重要作用。LACS屬于酰基CoA合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS）超家族，具有ACS家族的共同特征：其一是含有一個高度保守的AMP結合結構域（AMP-binding domain，PROSITE PS00455）， 是ATP的結合位點［9］；其二是含有ACS信號序列，可能是ACS的激活位點和脂肪酸結合部位［10］。與其他ACS不同的是，LACS蛋白具有一個由大約45個氨基酸殘基組成的連接域（linker）［11］。

高等植物LACS基因家族包含多個成員，對擬南芥LACS各成員的功能研究工作開展得較為深入。擬南芥基因組中共有9個LACS基因（AtLACS1-AtLACS9），除了AtLACS6和AtLACS7以外，均能互補LACS缺陷型酵母的表型，使其恢復生長［12］。其中AtLACS1編碼的蛋白定位于內質網，在發育的種子中優勢表達，與AtLACS9存在部分功能冗余，在種子油脂合成中發揮重要作用［13］。此外，AtLACS1還與表皮蠟質及花粉脂質的形成有關［13-14］。由于角質層是植物抵御生物和非生物脅迫的天然屏障，因此，LACS在植物抗逆響應中也具有重要作用［15］，擬南芥單或雙突變體如atlacs2和atlacs1atlacs2提高了表皮的滲透性、水分散失率和對干旱的敏感 性［16-17］。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發現LACS有4種形式，分別為Faa1p、Faa2p、Faa3p和Faa4p，其中Faa1p和Faa4p的催化活性較高，主要參與長鏈脂肪酸的活化［18］。

雖然LACS基因在擬南芥中已經有較為詳盡的研究，然而向日葵LACS基因在TAG合成和逆境脅迫中的作用至今仍不甚清楚。本研究通過分析向日葵基因組發現LACS為多基因家族，進一步從實驗室前期獲得的向日葵種子發育轉錄組發現，LACS家族成員在種子發育過程中呈現差異表達模式，篩選獲得一個包含完整編碼區的LACS基因序列，命名為HaLACS1，使用反轉錄PCR克隆獲得該基因并對其進行了生物信息學分析，研究其亞細胞定位、組織表達及在干旱、鹽和ABA處理下的表達模式，并通過酵母突變體功能互補試驗進一步明確HaLACS1編碼酶的活性和底物偏好性，以期為揭示該基因的功能及其在向日葵油脂合成和抗逆中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及處理 供試向日葵品種為油葵T303（含油量約49%），于2020年春季種植于石河子大學農試場試驗田。將開花后第0天的植株進行人工自花授粉，并做標記，取開花當天及油脂積累3個不同時期（初期、中期和后期，即開花后10、24和31 DAF（day after flowering））的種子，液氮速凍后于-80℃保存。

將向日葵種子播種于花盆中，置于溫室中培養［（25±2）℃，16 h光照/8 h黑暗］，當幼苗生長至2片真葉時，分別取根、莖、葉和子葉，液氮速凍后-80℃保存，同時以盆栽幼苗為材料，以無菌水處理為對照，進行不同濃度的鹽脅迫（0、150、200和300 mmol/L NaCl）處理24 h；干旱脅迫（15% PEG 6000）和外源ABA（100 μmol/L）處理0、1、3、6、12和24 h。每個樣品進行3個生物學重復。

1.1.2 菌株與主要試劑 pMD18-T載體購自TaKaRa公司。大腸桿菌（E. coli）DH5α、亞細胞定位載體pAN580-eGFP和酵母穿梭表達載體pYES2由石河子大學生命科學學院植物功能基因實驗室保存。pAN580帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）報 告 基 因。LACS缺陷型酵母（Saccharomyces cerevisiae）YB525菌株（faa1△faa4△）由朱駿教授（上海師范大學）惠贈。

1.2 方法

1.2.1 HaLACS1的克隆及序列分析 使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme，南京，中國） 提取向日葵總RNA，使用PrimeScriptTMReverse Transcriptase（TaKaRa，大連）反轉錄cDNA。根據向日葵基因組，用Primer Premier 5.0設計HaLACS1編碼區引物（L1F/L1R），并添加Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點，用于構建PYES2-HaLACS1載體（表1）。使用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預測HaLACS1蛋白分子量和等電點。使用MEGA 7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹，采用Clustal W結合GeneDoc軟件對蛋白序列進行比較和可視化分析。利用在線軟件PlantCARE與TBtools分析HaLACS1啟動子順式作用元件。

表1 引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.2.2 亞細胞定位分析 使用引物PF和PR擴增HaLACS1，經瓊脂糖凝聚檢測、純化后，與亞細胞定位載體pAN580-eGFP連接，構建融合表達載體pAN580-HaLACS1-eGFP。將構建好的融合表達載體、pAN580-eGFP空載體及mCherry-HDEL-eRFP（內質網定位marker）質粒分別轉化擬南芥原生質體，弱光下培養8-10 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP在細胞內的分布，判斷HaLACS1的亞細胞定位。

1.2.3 HaLACS1的表達分析 以向日葵18S rRNA（AF107577）基因為內參，使用ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）進行qRTPCR反應，分析HaLACS1的表達水平。反應程序為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量［19］。

1.2.4 HaLACS1 在酵母中的功能驗證 使用引物L1F和L1R（表1）擴增HaLACS1的編碼區序列，構建酵母表達載體pYES2-HaLACS1。采用LiAc轉化法［20］，分別將重組質粒和對照質粒pYES2轉化至LACS缺陷型酵母YB525中。轉基因酵母在含2%（W/V）半乳糖的尿嘧啶缺陷培養基（yeast synthetic drop-out agar medium without uracil，SCU）上進行誘導培養［21-22］。

1.2.5 底物偏好性分析 將轉基因酵母接種于SCU培養基中，培養至對數期中后期，收集酵母細胞。加入2 mol/L山梨醇清洗2次。將酵母細胞轉入3-5 mL SCU液體培養基（含2%半乳糖），30℃培養4 h，誘導外源基因表達。測OD600，然后吸取30 μL菌液加入到3 mL含2%半乳糖、98 μmol/L脂肪酸（C12： 0、C14：0、C16：0、C18：0、C18：1）的SCU液體培養基中，并添加0.1% Triton X-100溶解脂肪酸。30℃震蕩培養48 h，使用分光光度計測量菌體密度，推測HaLACS1催化反應的底物偏好性［23］。

1.2.6 酵母細胞油脂的檢測 利用蘇丹黑B染色法［24］分析轉基因酵母細胞中的油脂含量（脂肪粒散布在細胞質中，可被蘇丹黑B氧化成黑藍色，在580 nm波長下酵母細胞油脂含量與吸光值呈線性關系）。首先用無菌水懸浮收集半乳糖誘導后的酵母菌體，將OD600處菌液濃度調為0.5，5 000 r/min離心10 min收集菌體。用0.3%的蘇丹黑（蘇丹黑0.3 g，70%乙醇100 mL）染色15 min后，棄去染料，用70%酒精懸浮菌體漂洗3次后懸浮于無菌水， 測OD580。

1.2.7 統計和分析 采用SPSS 26.0（one-way ANOVA）和Duncan法對qRT-PCR和底物偏好性進行單因素方差和多重比較分析（P＜0.05）。使用SPSS 26.0和Turkey’s法對中性油脂含量進行單因素方差和多重比較分析。所有數據均用3個生物學重復的平均值±標準差（±s）表示，并使用GraphPad Prism 8.0.2進行繪圖。

2 結果

2.1 HaLACS1的克隆及序列分析

以向日葵cDNA為模板，擴增得到了1 980 bp的HaLACS1完整開放閱讀框（圖1-A）。該基因編碼659個氨基酸，分子量為74.672 kD，等電點為5.82，與擬南芥AtLACS1蛋白的同源性為64%，與萵苣（Lactuca sativa）LsLACS1的同源性為79%。通過染色體定位發現其位于第4染色體63 100 598-63 107 432基因座，具有19個外顯子和18個內含子（圖1-B）。將HaLACS1編碼的氨基酸序列與其他5個植物LACS氨基酸序列進行同源性比對，結果（圖2）顯示，向日葵HaLACS1蛋白序列中含有高度保守的AMP結合結構域（AMP-binding domain）和ACS信號結構域（ACS signature domain），同時HaLACS1還含有LACS酶特異的LACS特異的連接域（LACS-specific linker domain）。不同植物中LACS連接域的氨基酸序列相似性差異較大。保守結構域分析表明，HaLACS1具備LACS家族蛋白的共同特征，可以確定所克隆的基因為向日葵LACS基因。

圖1 向日葵HaLACS1的克隆（A）及染色體定位分析（B）Fig. 1 Cloning（A）and chromosome location（B）of the HaLACS1 gene in H. annuus

圖2 不同植物LACS1蛋白序列多重比對結果Fig. 2 Multiple alignment results of LACS1 proteins from different plants

2.2 HaLACS1啟動子序列分析

從向日葵基因組數據中獲得了HaLACS1開放閱讀框（ORF）上游2 000 bp的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE與TBtools對HaLACS1啟動子順式作用元件進行分析（圖3）。發現含有TATAbox（RNA聚合酶Ⅱ結合位點，可以保證轉錄精確起始）、參與厭氧誘導的ARE元件（AAACCA）、參與水楊酸反應的TCA元件（CCATCTTTTT）；另外還發現了GARE-motif（TCTGTTG）赤霉素、TGAelement（AACGAC）生長素及CGTCA-motif茉莉酸甲酯響應元件；除此之外，還發現低溫響應元件LTR（CCGAAA）和一個參與干旱誘導的MYB結合位點元件MBS（CAACTG）。結果表明，HaLACS1可能通過激素調控來發揮調節植物生長和響應外界環境脅迫的作用。

圖3 向日葵HaLACS1啟動子的順式作用元件Fig. 3 Cis-acting elements of the H. annuus HaLACS1 gene promoter

2.3 HaLACS1蛋白序列的系統發育分析

系統發育分析結果（圖4）表明，向日葵HaLACS1與擬南芥AtLACS1的同源性為64%，與萵苣LsLACS1同源性最高（79%）。HaLACS1與芝麻SiLACS1、蓖麻RcLACS1、花生AhLACS1、大豆GmLACS1等雙子葉植物LACS1在同一進化支上，與單子葉植物水稻、玉米、小麥的LACS蛋白同源關系較遠。而釀酒酵母與三角褐指藻的LACS蛋白序列聚為另一分支上，親緣關系較近。

圖4 向日葵HaLACS1蛋白與其他植物LACS1的系統進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic relationships of the HaLACS1 protein in H. annuus with other plant LACS1

2.4 HaLACS1的亞細胞定位分析

PCR擴增HaLACS1的編碼區，經SpeⅠ和NcoⅠ 雙酶切、測序、連接、轉化，獲得HaLACS1與綠色熒光蛋白（GFP）融合的表達載體pAN580-HaLACS1-eGFP。通過與攜帶紅色熒光蛋白（RFP）的mCherry-HDEL-RFP質粒共轉化擬南芥原生質體瞬時表達后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察定位情況。結果（圖5）表明，攜帶有GFP的HaLACS1與攜帶RFP的mCherry-HDEL-eRFP在共聚焦顯微鏡下可以共定位，表明HaLACS1定位于內質網。

圖5 HaLACS1在擬南芥原生質體中的亞細胞定位Fig. 5 Subcellular localization of the HaLACS1 protein in the protoplasts of Arabidopsis

2.5 HaLACS1組織特異性表達分析

使用qRT-PCR技術檢測HaLACS1在向日葵各組織中的表達情況，結果（圖6）表明，HaLACS1在向日葵根、莖、葉、子葉、花和種子中均有表達，在花和種子發育初期（10 DAF）表達量較高，其中，在種子發育早期表達量最高，是根中表達量的17倍，隨后表達量下降，推測HaLACS1參與向日葵種子的油脂積累，且發揮作用的時段主要為早期，同時該基因可能還與向日葵花器官中的油脂積累有關。

圖6 HaLACS1在不同組織中的表達Fig. 6 Tissue expression analysis of the HaLACS1 gene

2.6 HaLACS1對非生物脅迫和外源ABA的響應

向日葵是一種抗旱、耐鹽堿的作物，為了明確向日葵HaLACS1對干旱和鹽脅迫的響應，采用qRTPCR方法分析HaLACS1在2種脅迫下的表達情況。結果（圖7）表明，HaLACS1響應干旱和鹽脅迫，且不同組織（根、莖、葉）具有不同的響應模式。在干旱脅迫下（圖7-A），HaLACS1在莖和葉中的表達量呈“升-降-升”的趨勢，莖中的表達量在干旱處理1 h時達到最高，為對照的2倍左右，葉中表達量在處理12 h時達到最高，為對照的3倍左右。根中的表達量在處理后先降低，在3 h處其表達量開始升高，于12 h處達到最高，為對照的3倍左右。

用不同濃度NaCl（0、150、200和300 mmol/L）處理向日葵幼苗，處理24 h后檢測HaLACS1的相對表達量，結果（圖7-B）表明，供試組織（根、莖、葉）在150 mmol/L NaCl處理下，HaLACS1的表達較對照顯著上調，在根、莖和葉中的相對表達量約為對照的8-10倍。隨著NaCl濃度的升高，HaLACS1在莖、葉中的表達量呈下降趨勢，而在200 mmol/L NaCl脅迫后，在根中的表達下調，300 mmol/L NaCl脅迫后又顯著升高，表明HaLACS1受干旱和鹽脅迫誘導。

圖7 向日葵在干旱（A）和鹽（B）脅迫下不同組織中HaLACS1的表達分析Fig. 7 Relative expressions of the HaLACS1 gene in H. annuus tissues under drought（A）and salt stresses（B）

ABA處理后（圖8），HaLACS1在根中的表達在處理1 h時下調，然后持續上調，在12 h表達量最高，約為對照的2倍；HaLACS1在莖中的表達較對照顯著上調，在莖中12 h時表達量最高，為對照的5倍左右，在24 h時略有下調。在葉的表達量在ABA處理后出現“升-降-升”趨勢，在12 h時表達量最高，約為對照的3倍，表明HaLACS1受ABA 誘導。

圖8 向日葵在ABA處理下不同組織中HaLACS1的表達分析Fig. 8 Expression pattern of HaLACS1 in H. annuus tissues under ABA treatment

2.7 酵母功能互補試驗及底物偏好性分析

為明確HaLACS1是否具有LACS酶活性，構建pYES2-HaLACS1酵母表達載體，并轉化至LACS缺陷型釀酒酵母菌株YB525中，置于以脂肪酸為唯一碳源的液體培養基中培養。YB525為酵母LACS缺陷型菌株，不能在含有脂肪酸為唯一碳源的培養基中生長［25］。在培養基里添加不同鏈長的外源脂肪酸作為底物，根據酵母生長情況確定HaLACS1是否具有LACS酶活性，并探究HaLACS1的底物偏好性，以轉pYES2空載體的菌株為對照。結果（圖9）表 明，30℃震蕩培養48 h后，轉化pYES2-HaLACS1的酵母彌補了該突變菌株不能在以脂肪酸為唯一碳源的SCU培養基中正常生長的缺陷，恢復了其正常生長速率，說明HaLACS1具有LACS酶活性。并且轉基因酵母在棕櫚酸（C16：0）和油酸（C18：1）的培養基中生長速率更快，說明HaLACS1對底物 C16：0和C18：1脂肪酸具有偏好性。

圖9 重組酵母的生長狀況Fig. 9 Growth status of recombinant yeast cells

2.8 轉基因酵母油脂含量分析

半乳糖誘導48 h后的陽性酵母菌用于轉基因酵母的油脂檢測，通過蘇丹黑B染色法檢測酵母細胞油脂含量，結果（圖10）顯示，pYES2-HaLACS1的酵母轉化子中蘇丹黑B染色程度較對照顯著升高（P＜0.01），表明pYES2-HaLACS1的酵母轉化子相較于對照含有更高的油脂，說明HaLACS1可以提高酵母油脂含量。

圖10 重組酵母細胞的蘇丹黑B染色Fig. 10 Sudan black B staining of recombinant yeast cells

3 討論

LACS基因家族在高等植物中廣泛分布，在植物甘油酯的合成與分解、角質和蠟質合成、逆境響應等多個過程中具有重要作用。已有研究表明，高等植物LACS家族蛋白定位于不同的細胞器，如內質網［26］、葉綠體［27］、過氧化物酶體［26-28］和質膜［15，25］。前期研究發現，向日葵基因組中具有13個LACS基因家族成員，本研究從向日葵基因組中克隆了一個HaLACS1基因，與擬南芥AtLACS1具有較高的相似性。構建GFP融合表達載體在擬南芥原生質體中表達發現，HaLACS1定位于內質網，這與擬南芥同源蛋白AtLACS1的亞細胞定位結果一致［11］。前人也報道了向日葵中的2個LACS基 因［29］，本研究對其序列進行比對，發現已報道的這兩個向日葵LACS基因與擬南芥AtLACS8和AtLACS9的相似性較高，其中向日葵HaLACS8蛋白定位于內質網，HaLACS9蛋白定位于葉綠體。并且研究表明，位于不同細胞器中的LACS蛋白具有不同的生物學功能。位于質體中的LACS蛋白與質體中從頭合成的長鏈脂肪酸的激活有關，并參與質體和內質網之間的脂質運輸［26］。定位于過氧化物酶體的AtLACS6、AtLACS7和一種大豆蛋白GmLACS2參與脂肪酸的降解［26-27］。位于內質網的AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4和AtLACS8參與脂質的合成［12］。本研究發現HaLACS1定位于內質網，推測該蛋白可能與擬南芥中定位于內質網中的LACS蛋白具有相似的脂質合成功能。

研究表明，擬南芥AtLACS基因家族成員可在根、莖、葉、花和種子等多個器官中高表達［12-13］，其表達模式上的多樣化也印證了AtLACS基因功能的多樣化。其中，AtLACS1在擬南芥莖、葉表皮細胞、花和發育的種子中高表達，參與擬南芥表皮蠟和角質、花粉外壁脂質和種子TAG的合成等多個生物過程［12］。AtLACS1突變體導致莖和葉的C16角質單體分別減少了37%和22%，同時，AtLACS1具有超長鏈脂肪酸（C20-C30）合成酶活性，尤其對C30脂肪酸具有高活性，在擬南芥表皮蠟質代謝中發揮重要作用［14］。AtLACS1和AtLACS4雙突變體導致花粉敗育，花粉外壁脂質顯著降低［30］。AtLACS1和AtLACS9雙突變體的研究表明，二者在籽粒TAG的合成功能上存在部分冗余［13］，此外，AtLACS2、AtLACS4和AtLACS8也在擬南芥種子中高表達，在TAG的合成中發揮重要作用［15］。研究表明，HaLACS9在向日葵種子發育前期有較高的表達，HaLACS8主要在種子發育后期表達［29］。本研究克隆的HaLACS1在向日葵花和種子發育的前期（花后10 d）表達量較高。HaLACS1和HaLACS9雖然定位于不同的細胞器，但都在種子發育前期表現出最強的活性，說明其在向日葵種子TAG的合成功能上存在部分冗余，這與報道的擬南芥AtLACS1和AtLACS9相似［13］。而HaLACS8雖然定位于內質網，但在向日葵種子發育后期表現出高活性，推測這些基因的表達在種子發育過程中受到不同機制的調控。本研究結果推測HaLACS1參與向日葵花和種子中脂質的積累過程，尤其參與向日葵種子TAG合成早期的調控。

植物角質層的主要成分是超長鏈脂肪酸及其衍生物［31］，是隔離外界的天然屏障，具有防止植物非氣孔性失水、抵御病蟲害和非生物逆境等多種功能［32］。從蘋果中鑒定了11個MdLACS，其中多個MdLACS在ABA處理后表達上調，并且MdLACS1的過表達增強了蘋果愈傷組織對PEG、ABA和NaCl的耐受性，表明MdLACS1是響應非生物脅迫的重要調節因子［33］。異源表達2個蘋果LACS基因（MdLACS2和MdLACS4）導致擬南芥表皮細胞的滲透性降低，減少了水分散失，增強了轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性［34］。這些結果表明LACS在植物角質合成中的作用增強了植物的抗旱性。向日葵作為一種耐鹽堿、抗旱性較強的油料作物，在我國西北地區廣泛種植，探究向日葵的抗逆機制具有重要意義。在擬南芥中的研究表明，干旱、鹽和ABA均可誘導MYB轉錄因子家族中的MYB41高表達，而且可通過MYB41的下游調控基因AtLACS2來調控角質的合成，從而提高擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性［35］。本研究證實，ABA、PEG和NaCl脅迫均能誘導HaLACS1在向日葵莖、葉中的表達上調，并且該基因上游啟動子序列中包含MYB轉錄因子結合位點，因此，猜測HaLACS1受MYB轉錄因子調控參與向日葵角質的合成，與向日葵的耐逆代謝有關，具體功能有待進一步深入研究。

盡管擬南芥LACS酶是個小的多基因家族，但對不同碳鏈長度的脂肪酸具有明顯的底物偏好性差異，這與其功能差異和亞細胞定位是相一致 的［12，15］。棉花（Gossypium hirsutum）GhACS1偏好長鏈脂肪酸作為底物，尤其是油酸（C18：1）［28］。油菜（Brassica napus）BnLACS2參與種子油脂的合成，偏好肉蔻酸（C14：0）、軟脂酸（C16：0）、硬脂酸 （C18：0）、油酸（C18：1）和芥酸（C22：1）為底 物［5］。這些研究表明，LACS酶在高等植物中的功能較為保守。但由于種子油脂組分和脂質代謝過程在不同植物中具有多樣性的特點，LACS酶的底物偏好性在不同的植物中是不同的。為了明確向日葵HaLACS1的活性和底物偏好性，將HaLACS1轉入LACS缺陷型酵母細胞YB525中進行功能互補試驗，結果證明HaLACS1能夠補償酵母突變體YB525的生長缺陷，證實了HaLACS1具有長酰基輔酶A合成酶活性。通過在不同脂肪酸培養基中測定酵母的生長速率來間接分析其底物偏好性，結果表明，HaLACS1偏好軟脂酸和油酸等長鏈脂肪酸作為底物。在對酵母油脂含量的檢測中發現轉基因酵母的油脂含量顯著升高，結合HaLACS1定位在內質網的分析結果，說明HaLACS1參與了向日葵的油脂合成過程中軟脂酸和油酸的活化。

4 結論

成功克隆了一個向日葵長鏈酰基輔酶A合成酶基因HaLACS1，該基因全長1 980 bp，編碼659個氨基酸，分子量為74.672 kD，等電點為5.82。HaLACS1定位于內質網。該蛋白序列具有典型的酰基輔酶A合成酶特征。HaLACS1主要在向日葵種子發育早期高表達，可能參與向日葵種子油脂積累，并響應干旱、高鹽和ABA的調控。HaLACS1可能參與了向日葵油脂的合成代謝，并對軟脂酸和油酸具有偏好性。