母親MTHFD1及MTHFD2基因多態性與子代先天性心臟病的關聯

陳倩 黃鵬 宋欣俐 劉亦萍 孫夢婷 王婷婷 張森茂 秦家碧

（1.中南大學湘雅公共衛生學院流行病與衛生統計系，湖南長沙 410078；2.湖南省兒童醫院心胸外科，湖南長沙 410007）

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是新生兒中最常見的出生缺陷類型［1］，也是導致嬰兒死亡率升高的主要原因［2］。全球CHD 發病率約為0.9%，意味著全球每年至少有135 萬CHD 患兒出生［3］。目前許多學者認為CHD 是由于遺傳、環境等因素單獨或綜合作用的結果［4-5］。流行病學調查顯示，孕期葉酸的攝入可降低40%～60%子代CHD 的發生［6］。葉酸缺乏可導致高同型半胱氨酸血癥，國內外有研究表明母親同型半胱氨酸水平升高與子代CHD發生相關［7-8］。亞甲基四氫葉酸脫氫 酶1 （methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1，MTHFD1）基因位于染色體14q24，編碼的單一蛋白具有3 種酶的活性。MTHFD1基因編碼的C1 四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，THF）合成酶，通過其甲酰‐THF 合成酶活性催化甲酸和THF 向10‐甲酰‐THF 的轉化，是一碳單位進入葉酸代謝的切入點［9］。 亞 甲 基 四 氫 葉 酸 脫 氫 酶 2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2）是由第2 染色體上基因所編碼的線粒體酶，該酶于1960 年首次在埃利希腹水腫瘤細胞中發現［10-11］。MTHFD2具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶及環化水解酶的雙重活性，在葉酸代謝途徑中催化2個連續的反應，MTHFD1、MTHFD2是體內葉酸代謝產物相互轉化反應中的關鍵酶［12］。母親MTHFD1基因、MTHFD2基因缺陷可能會影響酶的活性，使葉酸代謝障礙及同型半胱氨酸再甲基化途徑受阻，從而引起同型半胱氨酸蓄積造成高同型半胱氨酸血癥。因此，母親MTHFD1基因、MTHFD2基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）可能通過影響葉酸與同型半胱氨酸代謝改變后代對CHD 的易感性。目前，關于母親MTHFD1基因、MTHFD2基因與子代CHD關聯的研究較少，既往研究只關注MTHFD1基因的個別位點（rs2236225、rs1950902、rs1076991、rs8010584）［13-20］， 事 實 上，MTHFD1基 因、MTHFD2基因還有許多其他位點有待研究。本研究是基于醫院開展的病例對照研究，旨在評估母親MTHFD1基因、MTHFD2基因多態性及基因之間的交互作用與子代CHD的關聯，為葉酸-同型半胱氨酸代謝通路上相關基因對CHD 的易感性提供流行病學依據，也為揭示葉酸預防出生缺陷的潛在作用機制提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究采用以醫院為基礎的病例對照研究，選取2017 年11 月至2020 年3 月在湖南省兒童醫院心胸外科就診的683 例CHD 患兒的母親作為病例組，選取同時間段內就診于同一家醫院并排除任何先天畸形的740例兒童的母親作為對照組。本研究已獲中南大學湘雅公共衛生學院倫理委員會審批（審批號：XYGW‐2018‐07），并進行了臨床試驗注冊（注冊號：ChiCTR1800016635）。

1.2 納入和排除標準

病例組納入標準：（1）經彩色多普勒超聲和/或手術確診患單純性CHD（除心臟畸形外未合并其他系統畸形）患兒的母親；（2）患兒母親彼此間無親緣關系；（3）自愿參加本研究并簽署知情同意書。病例組排除標準：（1）患兒合并其他先天性疾病；（2）雙胎或多胎妊娠；（3）非自然受孕；（4）民族為少數民族；（5）因患精神疾病、情緒極度不穩定而無法配合調查或對孕前、孕期暴露情況記憶不清；（6）與患兒無血緣關系；（7）無法提供血液樣本；（8）無法完成問卷調查。

對照組納入標準：（1）經病史詢問及臨床診斷排除了CHD和/或CHD以外的其他先天性疾病的患兒母親；（2）與病例無親緣關系，且對照彼此之間無親緣關系；（3）經項目告知后，自愿加入研究并簽署知情同意書。對照組排除標準：（1）雙胎或多胎妊娠；（2）非自然受孕；（3）民族為少數民族；（4）因患精神疾病、情緒極度不穩定而無法配合調查或對孕前、孕期暴露情況記憶不清；（5）與患兒無血緣關系；（6）無法提供血液樣本；（7）未完成問卷調查。

1.3 問卷調查

采用問卷調查以下內容：孕母的社會人口學特征（孕齡、文化程度、過去1年的家庭收入、民族和居住地）、家族史（近親婚姻、先天畸形）、既往不良妊娠史（自然流產、死胎、死產、早產、低出生體重、妊娠高血壓和妊娠糖尿病）、圍孕期感冒和發熱史、圍孕期生活行為史（主動吸煙、被動吸煙、飲酒史等）、圍孕期飲茶習慣、圍孕期環境污染接觸史、圍孕期葉酸服用情況、孕母染發或燙發和飼養或親密接觸寵物等。

1.4 DNA的提取和基因多態性檢測

在研究對象入組后24 h 內，由所在科室的護士采用乙二胺四乙酸抗凝管采集研究對象5 mL 外周靜脈血。血液采集后立即于4℃冰箱內保存并在12 h 內低溫運送回實驗室，3 500 r/min 下離心15 min，分離血漿及血細胞并進行分裝，標記研究對象分組及編號后保存于-80℃低溫冰箱。參考已發表的文獻所介紹的方法［21］篩選基因的待檢位點。具體為：檢索NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），查詢并核實MTHFD1、MTHFD2基因的主要SNP 位點，并結合HapMap 數據庫核實SNP位點信息，要求選擇tanSNP時r2所設的閾值不小于0.8 且要求各位點最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥10%。最終選擇了13個基因 位 點 （rs1950902、 rs2236225、 rs2236222、rs11849530、 rs1256146、 rs2236224、 rs1256142、rs34616731、 rs7571842、 rs702466、 rs828858、rs828903、rs1095966）作為本研究的待檢基因位點。利用MassARRAY 飛行時間質譜（Agena iPLEXassay，San Diego，CA，USA）對MTHFD1、MTHFD2基因的13個SNP 位點進行檢測，具體檢測工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.5 統計學分析

計數資料采用頻數和百分率或構成比（%）表示，2 組間計數資料的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，等級資料的比較采用Wilcoxon秩和檢驗。涉及多重比較時，采用錯誤發現率（false discovery rate，FDR）校正的方法調整P值以控制假陽性率，得到校正P值（QFDR），并以QFDR≤0.05為差異具有統計學意義。在描述比較基因多態性位點基因型分布頻率之前，對照組人群進行Hardy‐Weinberg平衡檢驗，P≥0.05則說明各基因頻率達到遺傳平衡。采用單因素和多因素logistic回歸分析，分別計算未調整和調整的相對危險比（odds ratio，OR）及95%可信區間（confidence interval，CI），并控制潛在的混雜因素，以檢驗母親MTHFD1、MTHFD2基因多態性與CHD 的關聯強度。利用Haploview 4.2 軟件計算不同SNP 位點之間的r2值，r2＜0.8 表明SNP 位點之間不存在連鎖不平衡；同時，利用四配子檢驗法構建單倍型，并分析各單倍型在病例組和對照組之間的分布。采用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）和logistic 回歸法分析基因-基因交互作用，在模型有統計學意義的情況下，測試樣本的準確度越大、交叉驗證一致性越接近10，其模型越好。

2 結果

2.1 2組基線資料的比較

病例組和對照組的基線數據匯總見表1。結果顯示，孕母居住地、文化程度、家庭年收入、家族成員有先天畸形史、近親婚配史、既往不良妊娠史（死胎或死產、妊娠糖尿病、妊娠高血壓）及圍孕期感冒或發熱史、葉酸補充、不良生活習慣（主動或被動吸煙、飲酒）、圍孕期環境污染物接觸史、圍孕期孕母染發或燙發和飼養或親密接觸寵物等指標在2 組間的比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在后續多因素分析中，這些因素將作為混雜因素進行控制。

表1 病例組和對照組的基線資料比較 ［n（%）］

2.2 對照組MTHFD1 和MTHFD2 基因位點Hardy‐Weinberg平衡檢驗

對 照 組MTHFD1和MTHFD2基 因 型Hardy‐Weinberg 平衡檢驗結果如表2～3 所示，對照人群MTHFD1和MTHFD2基因的13個位點的基因型分布均符合Hardy‐Weinberg 平衡定律（均P＞0.05），表明對照組的樣本人群具有良好的群體代表性。

表2 母親MTHFD1基因型分布頻率及對照組Hardy‐Weinberg平衡檢驗

表3 母親MTHFD2基因型分布頻率及對照組Hardy‐Weinberg平衡檢驗

2.3 母親MTHFD1 和MTHFD2 基因多態性與子代CHD的關聯分析

母親MTHFD1和MTHFD2基因上13個位點的SNP與子代CHD的關聯分析結果如表4～5所示。在調整表1基線資料比較中差異有有統計學意義的混雜 因 素 后， 母 親MTHFD1基 因rs1950902、rs11849530 和rs1256142 位 點 及MTHFD2基 因rs1095966位點的多態性與子代CHD存在關聯。

表4 （續）

表4 母親MTHFD1基因多態性與子代CHD的關聯

在位點rs1950902 上，攜帶AA 基因型的母親與攜帶GG基因型相比，子代CHD的風險顯著降低（OR=0.57，QFDR=0.040）。該位點的隱性模型（OR=0.62，QFDR=0.048）和加性模型（OR=0.78，QFDR=0.040）可降低子代CHD的風險。

在位點rs11849530 上，攜帶GA （OR=1.49，QFDR=0.011）或GG（OR=2.04，QFDR=0.002）基因型的母親與攜帶AA基因型相比，子代CHD的風險顯著增加。該位點的顯性模型（OR=1.62，QFDR=0.002）、隱性模型（OR=1.71，QFDR=0.009）和加性模型（OR=1.44，QFDR=0.001）與子代CHD 風險存在關聯。

在 位 點rs1256142 上，攜 帶GA （OR=2.34，QFDR＜0.001）或AA（OR=3.25，QFDR＜0.001）基因型的母親與攜帶GG基因型相比，子代CHD的風險顯著增加。該位點的顯性模型（OR=2.59，QFDR＜0.001）、隱性模型（OR=1.77，QFDR=0.001）和加性模型（OR=1.78，QFDR＜0.001）與子代CHD 風險存在關聯。

在 位 點rs1095966 上，攜 帶CA （OR=0.68，QFDR=0.032）基因型的母親與攜帶CC 基因型相比，子代CHD 的風險顯著降低。該位點的顯性模型（OR=0.68，QFDR=0.040） 和加性模型（OR=0.78，QFDR=0.032）可降低子代CHD的風險。

表5 母親MTHFD2基因多態性與子代CHD的關聯

2.4 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡分析顯示，母親MTHFD1和MTHFD2基因位點間不存在連鎖不平衡（r2＜0.8）。13個SNP位點共形成了3個單倍型塊（Block）（圖1）。SNP位點形成的單倍型在2組間的分布情況如表6 所示，Block1 內包含3個位點：rs2236225、rs2236224 和rs1256142，構成4 種單倍型：G‐G‐A、G‐G‐G、A‐A‐G 和G‐A‐G，其中G‐G‐G（OR=1.86，95%CI：1.53～2.26）、G‐A‐G （OR=1.35，95%CI：1.03～1.78）單倍型顯著增加子代CHD的風險（QFDR≤0.05）；Block2 內 包 含2個 位 點：rs1256146 和rs34616731，構成3 種單倍型：G‐T、A‐A、G‐A；Block3 內 包 含3個 位 點rs828858、rs828903 和rs7571842，構成4 種單倍型：T‐A‐G、T‐A‐A、A‐G‐G、T‐G‐G。

表6 SNP位點形成的單倍型在病例組和對照組中的分布情況

圖1 MTHFD1 和MTHFD2 基因各位點連鎖不平衡圖 圖中紅色方框代表位點連鎖不平衡的程度，顏色越深表示位點之間連鎖不平衡強度越強。框中數值為連鎖不平衡指標的具體值，接近于100，提示兩位點之間連鎖不平衡強度越強；接近于0，則提示兩位點連鎖不平衡強度越弱，即趨向于遺傳平衡。框上方數字1～13分別對應數字上方的位點rs號。

2.5 基因-基因交互作用分析

運用GMDR 分析母親MTHFD1和MTHFD2基因13個SNP 位點間的交互作用，結果如表7所示：2個位點（rs1950902、rs2236222）的一階交互作用、3個位點（rs1950902、rs1256142、rs1095966）的二階交互作用可能與CHD 的發生風險存在關聯（P＜0.05）。采用logistic回歸法分析上述3個位點的二階交互作用，顯示母親rs1950902 位點攜帶基因型GA+AA、 rs1256142 位點攜帶基因型GG、rs1095966 位點攜帶基因型CC（OR=0.02，95%CI：0.01～0.12），以及rs1950902 位點攜帶基因型GA+AA、rs1256142 位點攜帶基因型GG、rs1095966 位點攜帶基因型CC+CA（OR=0.32，95%CI：0.14～0.72） 可能降低子代CHD 的風險（QFDF＜0.05），見表8。

表7 MTHFD1和MTHFD2基因位點間交互作用分析

表8 MTHFD1和MTHFD2基因位點間交互作用的logistic回歸分析

3 討論

CHD 是影響兒童健康水平和人口素質的重大公共衛生問題［22］。研究母親葉酸代謝過程關鍵酶（如MTHFD1、MTHFD2）基因多態性與子代CHD的關聯，可為判斷親代是否為高風險個體提供科學依據。但目前相關研究多傾向于關注患兒MTHFD1基因多態性與CHD發生風險的關聯［13-19］，涉及母親MTHFD1基因多態性與子代CHD 風險的關聯的流行病學證據還十分有限。Cheng 等［20］發現母親MTHFD1基因rs2236225 位點多態性與子代CHD 存在有統計學意義的關聯，并且指出，CHD患兒的母親具有較低的葉酸水平及較高的血清同型半胱氨酸濃度，這從流行病學的角度部分解釋了母親rs2236225位點基因多態性和子代CHD發生的生物學合理性。然而，本研究未發現母親MTHFD1基因rs2236225 位點多態性與子代CHD 發生風險的關聯，與Song等［9］和Christensen等［15］研究結果一致。此外，本研究發現母親MTHFD1基因rs1950902、rs11849530 和rs1256142 位點多態性與子代CHD 存在有統計學意義的關聯，與Song等［9］研究結果一致。有研究者報道了MTHFD2基因多態性與癌癥的關聯［23］，但目前尚無關于MTHFD2基因多態性與CHD關聯的研究。

本研究分析了母親MTHFD1 和MTHFD2基因13個 位 點（rs1950902、rs2236225、rs2236222、rs11849530、 rs1256146、 rs2236224、 rs1256142、rs34616731、 rs7571842、 rs702466、 rs828858、rs828903、rs1095966）的SNP 與子代CHD 的關聯，結 果 表 明， 母 親MTHFD1基 因rs1950902、rs11849530、 rs1256142 位 點 及MTHFD2基 因rs1095966位點的多態性與子代CHD 存在關聯，沒有觀察到MTHFD1基因rs2236225 位點與子代CHD風險之間的顯著相關性，可能是由于不同人群之間的遺傳差異造成的，也可能是葉酸-同型半胱氨酸失衡對CHD 各亞型的易感性不同［24］。由于本研究中CHD 各亞型病例的樣本量有限，我們沒有分析特定CHD 亞型與母親MTHFD1、MTHFD2基因多態性之間的關聯。總的來說，本研究中涉及的一些多態性之前還沒有得到證實，而且關于母親MTHFD1、MTHFD2基因多態性與子代CHD關聯性的文獻仍然有限，需要更進一步、更明確的證據來明確其機制。

本研究在基因與疾病的關聯分析中，13個位點共形成了3個單倍型塊，Block1中的單倍型G‐G‐G和G‐A‐G顯著增加了子代CHD的風險。多數學者認為CHD 具有多基因遺傳疾病的特征，疾病的發生往往是由于多個基因共同作用的結果。不同基因之間或同一基因不同位點間可能通過相互作用影響疾病的發生發展，若研究忽略了基因-基因之間的交互作用，遺傳變異的真實效應則將無法被準確地描述出來［25］。目前關于母親基因-基因交互作用對子代CHD 影響的研究較少，且不同的研究所關注的基因及位點存在差異。本研究運用了GMDR 和logistic 回歸法分析基因-基因的交互作用，結果顯示，2個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs2236222）的一階交互作用、3個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs1256142、MTHFD2rs1095966）的二階交互作用可能與CHD的發生存在關聯。

本研究存在以下局限性：第一，本研究是以醫院為基礎的病例對照研究，通過問卷訪談的方式回顧性收集研究對象及其配偶圍孕期的相關暴露因素信息，可能存在回憶偏倚；第二，由于CHD 兒童是一個相對特殊的人群，不可能通過隨機抽樣來選擇研究對象，且本次研究只選擇了一家醫院，結果的代表性有待進一步研究；第三，由于樣本量的限制，本研究未對MTHFD1、MTHFD2基因多態性與不同CHD 亞型的關聯進行評估。

綜上所述，本研究顯示，母親MTHFD1基因rs1950902、 rs11849530、 rs1256142 位 點 和MTHFD2基因rs1095966 位點的多態性與子代CHD存在關聯，MTHFD1、MTHFD2基因位點構成的單倍型（G‐G‐G 和G‐A‐G）也與子代CHD 的發生有關。MTHFD1、MTHFD2基因2個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs2236222）的一階交互作用、3個 位 點 （MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs1256142、MTHFD2rs1095966）的二階交互作用可能與子代CHD 的發生風險存在關聯。然而，MTHFD1、MTHFD2基因的遺傳變異影響CHD發生的作用機制仍不明確，未來還需要開展更多研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無任何利益沖突。