瘦素對哮喘大鼠肺組織氧化應激及細胞凋亡的影響①

苗菲菲 劉兆瑋 田 鵬 張 紅 張長庚 （衡水市人民醫院，衡水 053000）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特點的氣道慢性炎癥性呼吸系統疾病，具有較高的患病率和致死率［1-2］。近年來，隨著氣候改變、霧霾、空氣污染等環境因素的改變，哮喘發的生率和病死率呈上升趨勢，并越來越受到社會的關注［3-4］。近來研究發現，機體氧化/抗氧化系統失衡，氧化應激產物增加，可引起肺動脈平滑肌細胞凋亡和組織損傷，并造成氣道炎癥加重及氣道重塑改變，從而參與哮喘發生過程［5-6］，故氧化應激反應在哮喘中的作用也受到研究者的日益重視。瘦素可表達于支氣管上皮細胞、氣道平滑肌細胞、肺泡上皮細胞等組織細胞，是一種脂肪性細胞因子樣蛋白多肽，可調節炎癥反應和免疫應答反應［7-8］。越來越多的研究發現，哮喘患者體內瘦素及其受體表達與哮喘病情進展關系密切［9-10］，然而針對外源性地給予瘦素對哮喘癥狀影響的相關報道較少。本研究建立哮喘大鼠模型，外源性給予瘦素及瘦素拮抗劑，探究其對哮喘大鼠支氣管肺組織氧化應激及細胞凋亡的影響，以期為闡明瘦素與哮喘病程的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠，體質量200～220 g，6～7周育齡，購于首都醫科大學實驗動物科學部［SCXK（京）2015-0006］，所有大鼠飼養于衡水市人民醫院動物房，飼養條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80 分貝，保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。本實驗經衡水市人民醫院倫理委員會批準，實驗動物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 瘦素（貨號：CYT-683，以色列ProSpec-Tany 公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（批號LS-F37731，上海康朗生物科技有限公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（批號：DM-M57136，上海篤瑪生物科技有限公司）；HE 染色試劑盒（貨號：LMO105，上海聯邁生物工程有限公司）；TUNEL 染色試劑盒（貨號：WLA029a，沈陽萬類生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（貨號：S311，上海研卉生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（貨號：YX-C-A401，武漢益普生物科技有限公司）；Kelch樣環氧氯丙烷樣相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-like associated protein 1，Keap1）抗體、核轉錄因子E2相關因子（nuclear transcription factor E2 related factor，Nrf2）抗體、血紅素氧合酶（heme oxygenase，HMOX-1）抗體、B 細胞淋巴瘤-2 基因（Bcl-2）抗體（貨號分別為：ab119403、ab62352、ab223349、ab196495，美國Abcam 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231，美國Pierce 公司）；反轉錄試劑盒（貨號：T1597，日本TaKaRa）；手動輪轉式切片機（型號：RM2125RTS，德國Leica 公司）；光學顯微鏡（型號：SMZ745，日本尼康公司）；蛋白電泳儀、半干轉膜儀（型號：1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像儀（型號：GIS-500，杭州Miulab公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型建立及分組給藥 參照文獻［11］采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏并用霧化吸入法誘發大鼠支氣管哮喘模型，具體操作方法為：將大鼠置于氣霧裝置內，用4%OVA 生理鹽水進行恒壓噴霧引喘，觀察大鼠的哮喘潛伏期（即從噴霧開始到哮喘發作的時間），一般不超過150 s，超過150 s 者認為不敏感，不予選用，將預選合格的40 只大鼠隨機分為模型組、瘦素組（10μg/kg）、瘦素拮抗劑組（3 μg/kg）及陽性對照組（布地奈德，1 mg/只），10 只/組。各組大鼠于兩側大腿外側肌內注射4%OVA 生理鹽水0.2 ml，腹腔注射0.5 ml 4%OVA+4%氫氧化鋁凝膠0.5 ml 致敏，1 次/周，共進行4 次致敏，若大鼠出現呼吸喘促、喘息、哮鳴音、甚則搔鼻、打噴嚏及鼻處有白色黏性分泌物表明造模成功，另取10只正常大鼠，于相同時間、相同方法給予等量生理鹽水作為正常對照組。各組大鼠均于造模成功后開始給藥，瘦素組及瘦素拮抗劑組參照文獻［11-12］設置劑量并通過腹腔注射給予相應劑量的瘦素及瘦素拮抗劑溶液，陽性對照組參照文獻［13］設置劑量，并通過噴霧給予布地奈德0.5 ml，正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水0.2 ml，各組大鼠均于給藥后1 h 按預選條件噴霧4%OVA 生理鹽水激發哮喘，各組大鼠均給藥致敏4周，1次/2 d。

1.2.2 各組大鼠一般行為觀察及肺功能檢測 各組大鼠均于末次引喘后24 h 觀察大鼠的神態、活動情況、呼吸狀況、皮毛狀態、口鼻等部位分泌物、咳嗽（或氣喘）等肺系疾病的特異性癥狀體征的變化。完成一般行為觀察后，用現配的4%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）進行腹腔注射麻醉，置于固定板，進行氣管插管，用動物肺功能測定儀測定大鼠的吸氣阻力（Ri）、呼氣阻力（Re）、肺通氣順應性（Cldyn）。

1.2.3 標本采集 各組大鼠在肺功能檢測后，立即經氣管注入4 ℃含酚紅（D-Hanks）的緩沖液5 ml，輕輕按摩胸部20～30 s 后，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），共3 次（回收率＞90%），將回收后的BALF 于4 ℃、2 500 r/min 下離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱。處死大鼠，取完整左右兩肺。剪取部分左肺用組織勻漿器勻漿、離心分離取上清液于-20 ℃冰箱中保存，剩余左肺及右肺組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h。

1.2.4 大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量及肺組織氧化應激指標SOD、MDA 含量檢測 取

1.2.3中-20 ℃冰箱保存的BALF上清液及肺組織勻漿液，于4 ℃冰箱解凍后，取BALF上清液，按試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α 含量。取肺組織勻漿液，按試劑盒說明書方法檢測肺組織中SOD、MDA含量。

1.2.5 大鼠肺組織HE 及TUNEL 染色觀察 取1.2.3 中4%多聚甲醛中固定24 h 的左右兩肺組織，進行常規透明、浸蠟、包埋后，切成5μm 厚的切片，取左肺組織切片，根據HE 染色試劑盒說明書進行染色、脫水、透明后封片，置于光學顯微鏡下觀察組織病理變化。取右肺組織切片，進行脫蠟、脫水、封閉后，添加TUNEL 工作液室溫下孵育1 h，隨后加入抗熒光猝滅劑封片，在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細胞凋亡情況，采用Image-pro plus 軟件系統定量檢測細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.6 Western blot 法檢測肺組織中Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白相對表達水平 取1.2.5 中剩余肺組織，以組織勻漿器勻漿、離心后取上清液，試劑盒提取蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 清洗3 次，加入一抗［Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2、β-actin（內參）］，稀釋倍數分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST 清洗后加入HRP 羊抗兔二抗（稀釋倍數1∶2 000），37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3 統計學分析 以SPSS22.0軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般行為檢測結果 正常對照組大鼠呼吸節律整齊、均勻，口唇顏色紅潤，口、鼻等部位無異常分泌物出現。模型組大鼠出現呼吸急促、喘息、哮鳴音、搔鼻、打噴嚏現象，且大多數大鼠口、鼻處有白色黏性分泌物。瘦素組大鼠出現呼吸減慢和節律不齊、四肢癱軟、腹肌痙攣、行動遲滯或俯伏不動現象。瘦素拮抗劑組及陽性藥物組大鼠呼吸漸復平穩、節律漸復均勻，極個別大鼠口、鼻處有白色黏性分泌物出現，偶爾有搔鼻、打噴嚏現象。

2.2 各組大鼠肺功能檢測結果 與正常對照組相比，模型組大鼠Ri、Re升高（P＜0.05），Cldyn降低（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠Ri、Re 升高（P＜0.05），Cldyn 降低（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽性藥物組大鼠Ri、Re 降低（P＜0.05），Cldyn升高（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽性藥物組相比，上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s，n=10）

表1 各組大鼠肺功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Cldyn/（ml·cm-1）0.23±0.04 0.12±0.031）0.04±0.021）2）0.17±0.031）2）3）0.18±0.041）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug Ri/（cm·s·ml-1）1.81±0.21 3.06±0.241）3.95±0.251）2）2.58±0.221）2）3）2.53±0.231）2）3）Re/（cm·s·ml-1）1.80±0.19 3.09±0.251）3.97±0.261）2）2.18±0.231）2）3）2.20±0.241）2）3）

2.3 各組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 及肺組織SOD、MDA 含量檢測結果 與正常對照組相比，模型組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量增多（P＜0.05），肺組織中SOD 含量減少（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量增多（P＜0.05），肺組織中SOD 含量減少（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽性藥物組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量減少（P＜0.05），肺組織中SOD 含量增多（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽性藥物組相比，上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α含量比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6 and TNF-α contents in BALF of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α含量比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6 and TNF-α contents in BALF of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

MDA/（cmmol·ml-1）2.21±0.20 6.53±0.231）8.39±0.251）2）4.08±0.221）2）3）4.13±0.211）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug IL-6/（ng·ml-1）169.91±20.89 692.06±25.261）890.58±29.041）2）369.13±23.121）2）3）359.02±22.131）2）3）TNF-α/（ng·ml-1）106.99±15.48 546.24±20.191）840.18±23.081）2）325.33±18.241）2）3）306.63±18.301）2）3）SOD/（cU·ml-1）20.05±1.48 12.53±1.091）8.02±1.011）2）16.08±1.221）2）3）16.13±1.211）2）3）

2.4 各組大鼠肺組織HE 染色檢測結果 正常對照組大鼠肺組織結構完整；模型組大鼠肺組織出現支氣管壁炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理損傷；瘦素組大鼠支氣管壁炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理損傷程度明顯增高；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑及陽性藥物組大鼠上述病理損傷減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

2.5 各組大鼠肺組織TUNEL 染色及細胞凋亡檢測結果 正常對照組大鼠肺組織染色均勻；與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織支氣管上皮細胞棕黃色顆粒物質沉積增多，凋亡細胞比例升高（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織支氣管上皮細胞棕黃色顆粒物質及凋亡細胞比例升高（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑及陽性藥物組大鼠肺組織支氣管上皮細胞棕黃色顆粒物質及凋亡細胞比例降低（P＜0.05），瘦素拮抗劑組與陽性藥物組相比，上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肺組織TUNEL染色（×400）Fig.2 TUNEL staining of lung tissue of rats in each group（×400）

表3 各組凋亡細胞比例比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of apoptotic cells in each group（±s，n=10）

表3 各組凋亡細胞比例比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of apoptotic cells in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Proportion of apoptotic cells/%10.62±0.22 42.09±0.251）60.03±0.261）2）22.39±0.231）2）3）21.25±0.241）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug

2.6 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達結果 與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽性藥物組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋 白 表 達 升 高（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽性藥物組相比，上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），見表4、圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達Fig.3 Expressions of Keap1，Nrf2，HMOX-1 and Bcl-2 protein in lung tissue of rats in each group

表4 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Keap1，Nrf2，HMOX-1，Bcl-2 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s，n=10）

表4 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Keap1，Nrf2，HMOX-1，Bcl-2 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Bcl-2/β-actin 1.01±0.11 0.49±0.091）0.14±0.101）2）0.79±0.091）2）3）0.81±0.101）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug Keap1/β-actin 1.02±0.10 0.46±0.081）0.12±0.081）2）0.79±0.091）2）3）0.80±0.091）2）3）Nrf2/β-actin 1.06±0.11 0.48±0.091）0.14±0.081）2）0.78±0.101）2）3）0.79±0.091）2）3）HMOX-1/β-actin 1.09±0.10 0.46±0.091）0.15±0.091）2）0.80±0.101）2）3）0.81±0.091）2）3）

3 討論

哮喘病因復雜，其發病機制至今尚不明確，而理想的哮喘動物模型對哮喘病因及發病機制的研究具有十分重要的意義［14］。OVA 來源于蛋清，價格便宜，具有很強的免疫源性，大鼠腹腔注射OVA 一段時間后，用OVA 霧化致敏，可誘發大鼠哮喘發作，此方法是目前國內外常用的動物哮喘造模方法［15］。本研究采用OVA 激發建立大鼠哮喘模型，與正常對照組相比，模型組大鼠出現呼吸急促、喘息、打噴嚏現象，且口、鼻處有白色黏性分泌物出現，BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量增加，肺功能指標Ri、Re增加，Cldyn降低，肺組織出現支氣管周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理現象，與文獻［16］研究動物哮喘癥狀及病理損傷結果一致，提示模型組大鼠出現氣道炎癥、通氣受限及支氣管肺組織炎癥損傷，表明大鼠哮喘模型建造成功。

近來研究發現，瘦素與哮喘關系密切，機體瘦素水平與哮喘嚴重程度呈正相關［9］。陳云峰等［17］發現外源性給予瘦素可抑制支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細胞β2 腎上腺素能受體（β2-AR）表達，促進炎癥因子釋放，并推測這可能是瘦素參與哮喘肺功能下降進程的原因。然而李桂茹等［12］發現外源性給予瘦素可降低機械通氣肺損傷中炎癥細胞因子的表達，降低肺損傷，與文獻［17］報道的瘦素促進炎癥介質、抑制氣道平滑肌細胞β2-AR 表達，加重哮喘患者肺功能損傷的結論相反。本研究給予哮喘大鼠瘦素及瘦素拮抗劑進行觀察，從正反兩面驗證瘦素與哮喘的關系。結果發現，與模型組相比，瘦素組大鼠呼吸加快、四肢癱軟、腹肌痙攣現象加重，BALF 中IL-6、TNF-α 含量及肺功能指標Ri、Re 進一步增加，Cldyn 進一步降低，肺組織支氣管壁炎癥浸潤、杯狀細胞增生及黏液分泌等病變進一步加重；瘦素拮抗劑和陽性藥物組大鼠上述哮喘癥狀、血清學指標、炎癥指標、肺功能指標及組織病理損傷與模型組相比均明顯減輕，表明外源性給予瘦素可加重哮喘癥狀和病理損傷，而瘦素拮抗劑可改善哮喘癥狀和病理損傷。然而瘦素加重哮喘進程的具體分子生物學機制還不甚明確，本研究對此進行繼續探究。

氧化應激反應在哮喘病理進程中發揮重要作用，KLENIEWSKA 等［18］發現機體內氧化應激產物，如活性氧蓄積，可引起生物膜上參與電子轉運的酶失活以及細胞溶解，從而產生組織損傷，并證明氧化應激過度反應是哮喘發病的關鍵環節。馬南等［19］發現氧化應激失衡參與了哮喘的發展，并推測氧化應激指標MDA 水平可作為哮喘嚴重程度及控制水平的監測指標。本研究發現，與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織氧化應激指標MDA 含量升高，SOD 活性降低，肺組織凋亡細胞比例升高，提示哮喘模型大鼠機體內存在氧化應激反應。Keap1-Nrf2通路與氧化應激和凋亡等密切相關，NAZIMA 等［20］發現Nrf2 的表達上調可促進Nrf2 與Keap1 解離，進而通過提高細胞抗氧化能力、消除過氧化產物堆積發揮抗氧化損傷作用；此外，Nrf2高表達通過促進抗凋亡因子Bcl-2 表達發揮抗凋亡作用。鄭憐玉等［21］發現黃連素可上調Nrf2、Keap1 表達，并激活Nrf2 下游抗氧化蛋白酶HMOX-1 表達，提高肺組織的抗氧化能力，進而降低肺組織氧化損傷。本研究發現，與正常對照組相比，模型組大鼠Nrf2、Keap1、HMOX-1、Bcl2 蛋白表達降低，提示哮喘模型組大鼠肺Nrf2-Keap1 通路被抑制，機體抗氧化應激能力減弱，肺組織損傷和細胞凋亡嚴重。而與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織Nrf2、Keap1、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達進一步降低，而氧化應激指標MDA 升高、SOD 降低，肺組織細胞凋亡比例進一步增加，表明瘦素具有促進哮喘癥狀和病理損傷進程的作用，其可能與抑制Nrf2-Keap1 通路激活，降低機體抗氧化應激反應和組織細胞凋亡作用有關。本研究還發現，瘦素拮抗劑組及陽性藥物組大鼠Nrf2 通路蛋白表達、氧化應激指標、肺組織細胞凋亡比例均顯著低于模型組，提示瘦素拮抗劑可能通過激活Nrf2-Keap1 通路表達促進機體抗氧化應激和抗凋亡作用，進而改善哮喘癥狀和病理損傷。

綜上所述，瘦素可抑制Nrf2-Keap1通路激活，降低機體抗氧化應激和抗凋亡作用，進而加重哮喘進程，可能為闡明瘦素參與哮喘病程的機制提供一定參考。但Nrf2 靶分子調控機制復雜，本研究未設置通路抑制劑進行實驗，這有待后續深入研究。