小檗堿通過mtROS-NLRP3通路抑制H2O2誘導的巨噬細胞焦亡①

蘇日娜 劉天怡 馬璐瑤 劉夢華 周 娜 郝 鈺

（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院免疫與微生物學系，北京 102488）

小檗堿（berberine，BBR）又名黃連素，是一種常見的異喹琳生物堿，是從黃連屬植物中提取的天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降脂、抗凋亡等多種生物活性。BBR 可以通過抑制各種炎癥介質的產生與表達，以及抑制炎癥信號通路的激活來減輕炎癥反應［1-2］。研究發(fā)現，BBR 可以同時通過抗炎、抗氧化等雙重作用治療糖尿病并發(fā)癥、非酒精性脂肪肝等多種炎癥性疾病［3-5］。進一步研究顯示，BBR 治療非酒精性脂肪肝的可能機制是在ROS/TXNIP 軸介導下，抑制NLRP3 炎癥體活化及其介導的細胞焦亡［6］。NLRP3作為目前研究最深入的固有免疫模式識別受體，受到刺激后可被激活并組裝成NLRP3 炎癥體，在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。ROS 是氧化應激的主要產物，機體受到損傷后生成的線粒體活性氧簇（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）被認為是NLRP3 炎癥體活化的關鍵調控因素之一［7］。本課題組前期研究亦發(fā)現BBR 可通過降低mtROS 的表達抑制NLRP3 炎癥體的活化，但其作用機制仍需進一步深入探究［8］。

NLRP3 炎癥體活化后可激活炎癥半胱氨酸Caspase-1，而活化的Caspase-1又可以切割下游焦亡執(zhí)行因子gasdermin D（GSDMD），使其產生具有細胞毒性的GSDMD-N 端并在細胞膜上打孔觸發(fā)細胞焦亡，一些促炎因子如IL-1β、IL-18通過該孔被分泌至胞外并進一步擴大炎癥反應［9-10］。本課題組已經發(fā)現BBR 對mtROS-NLRP3 信號通路有抑制作用，BBR 是否通過進一步抑制NLRP3 炎癥體介導的細胞焦亡來發(fā)揮抗炎作用呢？基于此，本研究中用H2O2處理細胞，構建線粒體氧化應激損傷模型，并以mtROS-NLRP3 信號通路介導的細胞焦亡為切入點，通過探討B(tài)BR 對巨噬細胞氧化應激損傷誘導的細胞焦亡的影響，進一步證實其抗炎抗氧化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞系J774A.1（北京協和細胞庫）儲存于北京中醫(yī)藥大學免疫與微生物學系實驗室液氮罐中。鹽酸小檗堿（中國食品藥品檢定研究 院，批 號：110713-201613）；過 氧 化 氫、NAC（Sigma）；SYBR-Green 熒 光 定 量PCR 試 劑 盒（ToYoBo）；RNA 提 取 試 劑Trizol、MitoTracker?Red CMXRos（Invitrogen）；BCA 試劑盒（Beyotime）；anti-NLRP3 抗 體（Cell Signaling Technology，Cat.No15101S）；小鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒（Bioleg?end，Cat.No 432604）；ROS 檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（碧云天生物公司）；FAM FLICA?Caspase-1 Assay Kit（Immuno Chemistry）；胎牛血清（HyClone）。引物采用Primer6.0 設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 培養(yǎng)J774A. 1 細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中。設置正常對照組（control組）、模型組（H2O2作用24 h）、BBR 干預組（H2O2+BBR 作用24 h）和NAC 干預 組（H2O2+NAC 作 用24 h）。 H2O2終 濃 度 為100 mmol/L，BBR 終濃度為16.8μmol/L，NAC 終濃度為1μg/ml。

1.2.2 免疫熒光法 將對數生長期的巨噬細胞J774A. 1接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中（1×106個/皿），細胞處理24 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗細胞，加入線粒體膜染料MitoTracker Red（1∶1 000）和ROS 熒光探針DCFH-DA（終濃度10μmol/L），37 ℃孵育30 min，棄染料，PBS 洗2 遍，加入DMEM 1 ml/皿，激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體和ROS 的共定位情況及ROS熒光強度。

1.2.3 RT-qPCR 取對數生長期的巨噬細胞J774A. 1 接種于6 孔板中（1×106個/孔），細胞處理24 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗細胞后加入Trizol 試劑裂解細胞（500μl/孔），并參照說明書提取各組細胞總RNA。依據反轉錄試劑盒說明，每組取1μg RNA配制成10μl 反轉錄體系以獲取相應的cDNA，隨后用DEPC 水將其10 倍稀釋。取1μl 稀釋后的cDNA作為模板，以小鼠GAPDH 基因作為內參，并加入相應的引物（表1），實時熒光定量法檢測各組樣品中NLRP3、IL-1β 基因的mRNA 水平。采用2-ΔΔCt法定量分析數據。

表1 設計并合成的引物Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

1.2.4 Western blot 收集各組巨噬細胞，加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白。以β-actin 作為內參蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒根據測定蛋白濃度，然后進行蛋白變性，每組蛋白上樣質量為20μg，經10%SDS-PAGE 電泳后，轉至PVDF 膜上電轉100 V 70 min。電轉后用5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，加入兔源抗NLRP3 抗體（1∶1 000 稀釋）及鼠源抗β-actin抗體（1∶5 000稀釋）室溫搖床孵育3 h或4 ℃過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗（均按1∶5 000稀釋），室溫搖床孵育1 h。TBST 洗膜3 次，HRP-ECL 超敏發(fā)光劑顯色、曝光。以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值進行半定量分析。

1.2.5 流式細胞術 細胞處理同1.2.3。①收集6 孔板內的細胞至1.5 ml EP 管內，用PBS 洗滌后，加入DCFH-DA（終濃度10 μmol/L），37 ℃孵育30 min，棄染料再用PBS洗滌2遍，重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。②各組細胞刮下后，PBS洗滌，每管加入FLICA?caspase-1 染色工作液（1∶30）重懸細胞并混勻，放入培養(yǎng)箱中避光孵育1 h 后，配制1×Wash Buffer 洗滌細胞，加入PI 染色液（1∶1 000）重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.6 檢測細胞培養(yǎng)液上清中LDH 和IL-1β 的釋放水平 具體操作參照相應試劑盒說明書。

1.3 統計學處理 實驗數據用SPSS20.0 軟件進行統計分析。實驗結果以±s表示。多組差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用LSD 法（方差齊時）或Games-Howell 法（方差不齊時）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BBR 對H2O2刺激的巨噬細胞線粒體釋放ROS的影響 流式細胞術結果顯示，與對照組比較，模型組中巨噬細胞生成的ROS明顯增多（圖1A），激光共聚焦顯微鏡結果進一步發(fā)現模型組中增多的ROS 與線粒體有明顯的共定位關系（圖1B），與模型組比較，BBR 或NAC 干預后ROS的生成及與線粒體的共定位顯著減少（P＜0.01，圖1）。

圖1 BBR對H2O2刺激的巨噬細胞mtROS產生的影響Fig.1 Effects of BBR on production of mtROS in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.2 BBR 對H2O2刺 激 的 巨 噬 細 胞 中NLRP3 及IL-1β mRNA 表達的影響 熒光定量PCR 結果顯示，與對照組相比，模型組（H2O2）巨噬細胞中的NLRP3 及IL-1β mRNA 水平顯著升高；與模型組相比，BBR 加藥組和NAC 組可明顯下調巨噬細胞中的NLRP3及IL-1β mRNA的表達水平（圖2）。

圖2 BBR 對H2O2 刺激的巨噬細胞中NLRP3 及IL-1β mRNA表達的影響Fig.2 Effects of BBR NLRP3 and IL-1β mRNA expres?sion in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.3 BBR 對H2O2刺激的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，同對照組相比，模型組巨噬細胞中NLRP3 的相對表達量增高，與模型組相比，BBR或NAC干預后可降低NLRP3的表達量（圖3）。

圖3 BBR 對H2O2刺激的巨噬細胞中NLRP3 蛋白表達的影響Fig.3 Effects of BBR on protein expression of NLRP3 in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.4 BBR對H2O2刺激的巨噬細胞Caspase-1活性及其介導的焦亡的影響 流式細胞術結果顯示，與正常組相比，模型組細胞Caspase-1 活性顯著升高；與模型組相比，小檗堿干預組細胞Caspase-1活性顯著下降（圖4A）；同時，模型組中Caspase-1 介導的細胞焦亡率較正常組亦顯著升高，而BBR組和NAC組中Caspase-1 介導的細胞焦亡率較模型組顯著降低（圖4B）。

圖4 BBR 對H2O2 刺激的巨噬細胞Caspase-1 活性及其介導的焦亡的影響Fig.4 Effects of BBR on Caspase-1 activity and pyroptotic rate of J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.5 BBR 對H2O2刺激的巨噬細胞中LDH 釋放水平的影響 檢測不同處理組巨噬細胞釋放的LDH 結果顯示，與正常組相比，模型組巨噬細胞釋放LDH水平顯著升高；BBR 組及NAC 組巨噬細胞釋放的LDH 水平相對于模型組均顯著降低（圖5）。

圖5 BBR對H2O2刺激的巨噬細胞中LDH釋放水平的影響Fig.5 Effects of BBR on release of LDH in J774A. 1 cells stimulated by H2O2

2.6 BBR 對H2O2刺激的巨噬細胞中IL-1β 分泌水平的影響 與正常對照組相比，模型組細胞上清液中IL-1β 分泌水平顯著升高；與模型組相比，BBR 組和NAC組的IL-1β分泌水平顯著下降（圖6）。

圖6 BBR 對H2O2 刺激的巨噬細胞中IL-1β 分泌水平的影響Fig.6 Effects of BBR on secretion of IL-1β in J774A. 1 cells stimulated by H2O2

3 討論

大量證據表明，人類疾病的發(fā)病機制與氧化應激的增加有關［11］。ROS 是氧化應激的主要產物，細胞ROS 的主要來源是線粒體，各種應激條件，包括代謝率增加、缺氧或膜損傷，都顯著地誘導mtROS的產生［7］。本研究結果顯示，氧化應激誘導劑H2O2處理的巨噬細胞中mtROS 水平顯著增加，BBR 干預可明顯減低mtROS 的累積，說明BBR 能夠抑制mtROS 的累積從而減輕H2O2誘導的巨噬細胞氧化應激損傷。

氧化應激和炎癥密切相關，在疾病的病理發(fā)展過程中常同時出現。作為固有免疫系統的重要組成部分，NLRP3 炎癥體的過度活化在病毒感染、糖尿病、痛風、炎癥性腸病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。NLRP3 炎癥體的活化需要雙信號：①啟動信號-NLRP3識別胞質中病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs），通過激活轉錄因子NF-κB 促進NLRP3 和前白細胞介素-1β（pro-IL-1β）的基因表達上調；②活性氧（ROS）的產生、離子通量的改變、溶酶體破裂等被認為是NLRP3炎癥體激活的觸發(fā)因素［12-13］。在以上分子事件的刺激下，NLRP3 炎癥體組裝并激活Cas?pase-1，活性caspase-1 切割細胞因子pro-IL-1β 和pro-IL-18 促進其成熟［14-15］。研究發(fā)現線粒體ROS 有助于NF-κB 信號通路的活化、促炎細胞因子的釋放，抑制mtROS 可消除低氧誘導的大鼠內皮細胞中NF-κB活化和IL-6分泌［16］。線粒體ROS更是被看作NLRP3 炎癥體激活的主要調控因子，特別是在NFκB 信號通路的激活和炎癥小體組裝方面都發(fā)揮了重要作用［7］。本課題組前期研究亦有相同發(fā)現，誘導相關抗氧化基因的表達可以清除過量的ROS，繼而抑制NF-κB 核轉位，減少NLRP3 炎癥體活化［17］。本研究結果顯示，在H2O2處理巨噬細胞構建的線粒體氧化應激損傷模型中，隨著mtROS 的累積，NLRP3 和IL-1β 的基因表達顯著提高，NLRP3 的蛋白表達量增多，Caspase-1 活性增強；加入ROS 清除劑NAC后NLRP3炎癥體的活化被顯著抑制，進一步確證了mtROS 對NLRP3 炎癥體活化的調控作用，BBR 干預后，能夠明顯抑制mtROS 的表達并進一步抑制NLRP3炎癥體的活化。

NLRP3 炎癥體的激活對依賴于Caspase-1 的經典細胞焦亡途徑至關重要。NLRP3 炎癥體激活后促進pro-caspase-1 的活化，活化的Caspase-1 不僅能將pro-IL-1β 和pro-IL-18切割成熟的生物活性形式，還能切割GSDMD，解除其自身C 端結構域對N 端結構域的結構抑制，GSDMD N 端具有成孔活性，可以在細胞膜上打孔，觸發(fā)一種細胞腫脹裂解性的促炎細胞死亡形式，稱為焦亡［9］。當胞膜的完整性遭到破壞時，細胞發(fā)生滲漏，LDH 及成熟的細胞因子IL-1β 和IL-18 向胞外釋放并募集更多炎癥細胞，擴大局部炎癥反應［18-19］。本研究實驗結果顯示，H2O2處理巨噬細胞后，細胞上清中IL-1β 的分泌水平和LDH 釋放量顯著增多，Caspase-1介導的細胞焦亡率也顯著升高，提示H2O2能誘導巨噬細胞發(fā)生細胞焦亡。而BBR能夠減輕Caspase-1介導的細胞焦亡、減少IL-1β的分泌水平和LDH的釋放。

綜上所述，H2O2誘導的巨噬細胞線粒體氧化損傷可以產生大量ROS，累積的ROS 促進NLRP3 炎癥體的活化繼而激活Caspase-1依賴的細胞焦亡，促使成熟的IL-1β 釋放至胞外放大局部炎癥反應。BBR通過減少線粒體釋放的ROS 來抑制NLRP3 炎癥體活化，進而抑制活化的Caspase-1 介導的細胞焦亡，減少IL-1β 的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究以mtROS-NLRP3-焦亡為切入點，進一步充實BBR 抗炎抗氧化的理論機制，為臨床治療相關疾病豐富了理論基礎。