燕山板栗種皮、種仁的抗氧化性分析

趙玉華，趙麗男，吳家秀，常學東

（1 河北科技師范學院食品科技學院 河北昌黎 066600；2 板栗產業技術教育部工程研究中心；3 河北省板栗產業協同創新中心；4 河北科技師范學院鄉村振興研究中心）

板栗有著“干果之王”的美稱，是我國的一種特殊種質資源[1]，它的油脂含量不高但是淀粉含量很高，干板栗的碳水化合物可以達到77%，鮮板栗碳水化合物含量也有40%之多，鮮板栗蛋白質含量為4%～5%[2-3]。板栗的外殼很容易剝落，板栗的口感味甜質糯，是一種很好的烹調食品[4]。

我國板栗栽培歷史十分悠久[5]，分布地域遼闊，主要栽培的省份在北方有河北、河南、山東等，南方有湖北、安徽等省份[6]。其中以華北各省板栗產量最多，大約占我國板栗產量的1/5[7-8]。

經過漫長的培育和馴化，已形成了極為豐富的品種資源。根據地區氣候、土壤條件、栽培方式、人工選擇方向和品種特點等因素，可以把我國的板栗品種劃分為5 個地方品種群：華北品種群，長江流域品種群，西北品種群，東南品種群和西南品種群[9]。其中華北地區的板栗具有風味獨特，澀皮易剝落等特點，是我國出口創匯的重要農產品[10]。

板栗又被稱為“腎之果”，具有強筋健骨、美容養顏的作用[2，6]，其抗氧化能力正在逐步展開研究。酚類和酮類是研究較多的抗氧化物質，國外對食品中多酚類化合物的測定方法的研究開展相對較早，常用的測定方法有ABTS（2-2 連氮-3-乙苯-二噻唑-6 硫酸）測定法[11-12]、DPPH（2，2-聯苯-1-三硝基苯肼）測定法[13]、弗雷米自由基還原法[14-15]和FRAP 法（Fe3+還原法）[16]。近幾年發展的新方法主要有HPLC（高效液相色譜）、GC（氣相色譜）、FC（Folin Ciocalteu）比色法、循環伏安法[17]等。其中色譜法還衍生出了許多與其他儀器（質譜、紫外）聯用的新技術，如：GC-MS（氣質聯用）、LC-MS（液質聯用）、GC-MS-SIM（氣相色譜-質譜-選擇離子監測）、HPLC-UV（紫外探測反相高效液相色譜法）、HPLC-DAD（高效液相色譜-二極管陣列檢測器聯用儀）法等[18]。

黃酮類化合物主要是由植物光合作用產生的，它的結構母核是以C6-C3-C6為骨架的2-苯基色原酮。目前已知的此類化合物達2000 余種，有黃酮類和類黃酮類，還包括（異）黃烷酮、黃酮醇、黃烷酮醇、雙黃酮及其衍生物。結構決定性質，所以我們在研究黃酮類化合物的性質時就需要對其結構進行鑒定[19]。DPPH為有機溶劑中的穩定自由基，其乙醇溶液為深紫色，具有單一電子，能夠接受一個電子或是氫離子，在波長為517 nm 下具有最大的光吸收。自由基清除劑存在的情況下，DPPH 的單電子被捕捉使其顏色較淡，在最大光吸收波長處的吸光值下降并呈線性關系，故可利用紫外-可見分光光度儀對DPPH 自由基的捕獲情況進行檢測，以評價測試樣品的抗氧化能力[20]。

近年來，國內外有關酚類物質的研究多集中于蘋果、葡萄等樹種[21-22]，而對板栗各個部位抗氧化性分析比較的研究相對較少。本文以燕山板栗為研究對象，采用DPPH 法對其外種皮、內種皮、種仁部位的抗氧化活性和抗氧化性物質的含量進行了測定，并對不同部位之間抗氧化活性和抗氧化性物質的含量進行了比較分析，以期為板栗功效的深入研究及產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 燕山板栗（早豐、燕奎、大板紅、燕紫、燕麗、紫珀、遵玉、短枝、燕龍）采購于唐山市遷西縣板栗科技示范園，采收后的板栗貯藏于昌黎果樹研究所的機械冷庫（-2±1 ℃）中。

1.2 儀器和試劑 儀器：分光光度計（VIS-723），上海精密科學儀器有限公司分光儀器總廠；LGJ-18B 型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；電子天平（JA2003 型），上海良平儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋（H.H.S 型），上海醫療器械五廠；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

供試試劑：DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，C18H12N5O6，相對分子質量394.3，純度90%，Sigma-Aldrich 公司）、無水乙醇、沒食子酸、蘆丁醇。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 將板栗剝殼，然后將板栗種仁切成片，最后將切成片的種仁和外種皮、內種皮分別冷凍干燥后研磨成粉，備用。

1.3.2 黃酮提取 提取溫度為60 ℃，80%乙醇提取1.5 h（浸提3 次），液料比10∶1，8000 r/min 離心得上清液，取1 mL 上清液至10 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.3 mL，放置6 min，再加10%硝酸鋁0.3 mL，放置6 min，再加4% NaOH 4 mL 定容至刻度，搖勻后，510 nm 處測吸光值[23]。以濃度（x）與吸光度（y）進行線性回歸得方程：y=9.4165x-0.0088 R2=0.9996[23]。

1.3.3 總酚的提取 準確稱取0.5 g板栗樣品，用30%乙醇溶液超聲提取，液料比為18∶l，超聲140 min，超聲溫度80 ℃[24]。超聲冷卻后于離心機中8000 r/min離心10 min，取1 mL 提取液于25 mL 容量瓶中，再加4 mL蒸餾水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH7.5 磷酸鹽緩沖液定容至刻度。空白實驗：取1 mL 蒸餾水于25 mL 容量瓶中，加4 mL 蒸餾水和5 mL 酒石酸亞鐵溶液，用pH7.5 磷酸鹽緩沖液定容至刻度。采用分光光度計，540 nm 處測吸光值，計算出標準曲線：y=0.0172x+0.0079 R2=0.9993。酒石酸亞鐵溶液配制方法：準確稱取1 g 硫酸亞鐵和5 g 酒石酸鉀鈉混合后加蒸餾水溶解定容至1000 mL。pH7.5 磷酸緩沖液的配制方法：稱取0.20 g Na2HPO4·12H2O 和5.00 g NaH2PO4·12H2O，混合后加蒸餾水定容至1000 mL[25]。

1.3.4 提取物對DPPH自由基的清除試驗 DPPH溶液的配制：準確稱取20 mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容至250 mL 容量瓶中，搖勻，作為儲備液（2.0×10-4mol/L），0～4 ℃避光保存[20]。分別將2.00 mL的各試樣提取溶液和2.00 mL DPPH自由基溶液加入到同一具塞試管中，總體積為4.00 mL，混勻，30 min后倒入比色皿中，在517 nm處測量吸光度，測量結果用A1表示。同時測定2.00 mL DPPH 自由基溶液和2.00 mL 無水乙醇混合后的吸光度，測量結果用A0表示；2.00 mL 相同試樣溶液和2.00 mL 無水乙醇混合后的吸光度，測量結果用A2表示。根據公式計算抑制率。抗氧化性以抑制率為指標，隨著抑制率的增加，其抗氧化能力也隨之增強。清除率計算公式：DPPH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100%[20]。

2 結果與分析

2.1 燕山板栗不同部位抗氧化活性與主要抗氧化性物質的含量 多酚類和黃酮類化合物是板栗體內重要的抗氧化性物質。由表1 可知，板栗中多酚和黃酮含量較高的部位是內種皮和外種皮，且不同種類之間含量也有所不同。9 個板栗品種中，不同部位多酚含量變化范圍為5.1～49.5 mg/kg，其中短枝、早豐、遵玉、紫珀、燕紫、燕龍、燕麗、燕奎的內種皮多酚含量較高，大于40 mg/kg，板栗種仁中多酚含量較少，為5 mg/kg左右；黃酮含量范圍在13.8～157 mg/kg 之間，其中遵玉、紫珀、燕龍、燕麗、燕奎的內種皮黃酮含量較高在140 mg/kg之上，各個品種果仁中黃酮含量較少，大概是14 mg/kg。

表1 板栗種皮、種仁抗氧化活性與主要抗氧化性物質的含量

不同板栗品種的內種皮抗氧化活性在43%～71%（DPPH 清除率）之間，其中燕龍內種皮、燕紫內種皮、早豐內種皮的抗氧化活性較高，均在68%（DPPH清除率）以上。

在種仁的抗氧化活性比較中，早豐種仁、燕紫種仁、燕龍種仁的抗氧化活性較高，在45%（DPPH 清除率）以上；外種皮的抗氧化活性沒有顯著性差異，大約1%（DPPH 清除率）。

2.2 燕山板栗外種皮內種皮種仁中多酚、黃酮含量及DPPH 清除率的方差分析 由表2 可知，對所測定的9 個燕山板栗品種外種皮、內種皮、種仁中多酚、黃酮含量及DPPH 清除率的方差分析表明：9 個板栗品種外種皮、內種皮、種仁中多酚和黃酮含量具有顯著性差異；在抗氧化活性方面，供試的9 個板栗的外種皮、內種皮、種仁的抗氧化活性（DPPH 清除率）具有顯著性差異。

表2 板栗外種皮內種皮、種仁中多酚、黃酮含量及DPPH 清除率的方差分析

2.3 板栗不同部位的DPPH 清除率方差分析 由表3 可知，板栗不同部位的DPPH清除率方差分析表明：燕紫內種皮的DPPH 清除率和燕龍、早豐的差異不顯著，燕麗內種皮的DPPH清除率和燕奎的差異不顯著，大板紅和遵玉內種皮的DPPH 清除率差異不顯著，其它品種之間差異顯著；燕紫外種皮的DPPH 清除率和燕奎、遵玉的差異不顯著，燕龍和大板紅內種皮的DPPH清除率差異不顯著，早豐和紫珀內種皮的DPPH清除率差異不顯著，其它品種之間差異顯著；燕紫、燕龍和早豐種仁的DPPH 清除率差異不顯著，燕麗、大板紅、遵玉的DPPH 清除率差異不顯著，燕奎和紫珀DPPH 清除率差異不顯著。

表3 板栗種皮、種仁的DPPH 清除率方差分析

2.4 板栗種皮、種仁的黃酮含量方差分析 由表4 可知，板栗種皮、種仁的黃酮含量方差分析表明：燕紫內種皮的黃酮含量和大板紅、早豐的內種皮黃酮含量無顯著性差異，燕麗、燕奎、遵玉、紫珀內種皮的黃酮含量無顯著性差異，短枝、燕紫、燕麗和燕龍的內種皮黃酮含量具有顯著性差異；燕紫、燕麗、短枝、早豐的外種皮黃酮含量差異不顯著，燕龍和燕奎的外種皮黃酮含量差異不顯著，燕龍、遵玉、燕紫、大板紅和紫珀外種皮黃酮含量有顯著性差異；燕紫、燕龍、燕奎和遵玉種仁的黃酮含量差異不顯著，燕麗、大板紅、紫珀種仁的黃酮含量差異不顯著，燕紫、燕麗、早豐和短枝的種仁黃酮含量有顯著性差異。

2.5 板栗種皮、種仁的多酚含量方差分析 由表5 可知，燕紫、燕麗和早豐內種皮的多酚含量差異不顯著，燕龍、短枝、遵玉、紫珀內種皮的多酚含量無顯著性差異，大板紅、燕紫、燕龍和燕奎內種皮的多酚含量有顯著性差異；燕紫、燕麗、早豐、遵玉和紫珀外種皮的多酚含量無顯著性差異，燕龍、燕奎和短枝外種皮的多酚含量差異不顯著；燕紫、燕麗、大板紅、遵玉、紫珀種仁的多酚含量差異不顯著，燕龍、燕奎、短枝、早豐種仁的多酚含量差異不顯著。

3 結論與討論

通過對板栗樣品的DPPH 清除率和多酚、黃酮含量的測定分析，發現同一板栗品種的內外種皮或種仁的DPPH 清除率和多酚、黃酮含量的差異均顯著，不同品種板栗內外種皮或種仁的DPPH 清除率和多酚、黃酮含量差異不顯著。板栗內種皮和外種皮中多酚和黃酮的含量高，種仁中多酚和黃酮含量較低，內種皮和種仁的DPPH 清除率大，抗氧化活性強，外種皮的DPPH 清除率小，抗氧化活性弱。

對板栗的抗氧化性物質提取及其生物活性的研究進行深入挖掘，開發出具有功能性的食品和飲料，既可以為人類健康作貢獻，又可以創造出更大的經濟效益，對板栗的發展起到了促進作用，使板栗加工業能更加全面系統。我們在加工處理過程中不僅要把種仁利用起來更要把內外種皮利用起來，發揮板栗內外種皮的食用價值和藥用價值。