優(yōu)化有機氮源提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產ε-聚賴氨酸效率

劉宇翔，柳天一，鄧玥，王靚，張宏建，張建華，陳旭升*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)，1977年由日本學者于鏈霉菌發(fā)酵液中首次分離到，是陽離子同型氨基酸聚合物[1]，一般由25～35個L-賴氨酸殘基通過ε-氨基和α-羧基間的酰胺鍵連接而成[2]。由于其多陽離子的性質可通過離子吸附與攜帶負電荷的細胞表面相互作用，故對于包括革蘭氏陽性和陰性細菌、酵母菌、霉菌甚至病毒在內的多種微生物都表現(xiàn)出良好的抑菌活性[3]。目前，ε-PL及其鹽酸鹽已獲得日本、韓國、美國、中國等國家和地區(qū)批準用作天然食品防腐劑[4]。此外，ε-PL還在藥物載體、納米粒、基因載體、脂質體、干擾素誘導劑、脂肪酶抑制劑和水凝膠等多個領域有著廣闊的應用前景[5]。

如何提高ε-PL發(fā)酵產量并降低其生產成本一直是學術界和產業(yè)界關注的核心問題。發(fā)酵培養(yǎng)基組分是微生物菌體生長和產物合成的物質基礎，也是影響微生物目標產物積累量的關鍵。同時，相比于通過育種手段提高目標產物發(fā)酵產量，培養(yǎng)基組分和比例優(yōu)化是一種簡單、有效提高目標產物濃度、降低生產成本的方式之一。為此，GUO等[6]對ε-PL發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和有機氮源進行了優(yōu)化，ε-PL搖瓶產量達到0.95 g/L，較優(yōu)化前提高了43.1%；5 L罐ε-PL產量提高至25.5 g/L，較優(yōu)化前增加了56.4%。發(fā)酵時間由174 h縮短到120 h，顯著提高了ε-PL生產強度。CHHEDA等[7]則對StreptomycesnourseiNRRL 5126發(fā)酵生產ε-PL的碳源、有機氮源和無機氮源進行了優(yōu)化，使得ε-PL發(fā)酵產量提高了1倍。BHATTACHARYA等[8]開發(fā)了一種人工神經(jīng)網(wǎng)絡-粒子群算法(artificial neural network particle swarm optimization，ANN-PSO)對ε-PL發(fā)酵培養(yǎng)基進行改良，通過模型推演，確定了最佳的培養(yǎng)基組合，ε-PL產量提高了1倍，達到74 mg/L。本團隊對Streptomycessp.M-Z18發(fā)酵生產ε-PL的碳源種類和用量進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)以甘油作為碳源時，搖瓶ε-PL產量是以葡萄糖為碳源的近3倍，達到了2.27 g/L[9]；而將甘油與葡萄糖按照質量比1∶1進行混合發(fā)酵時，最高ε-PL產量可達到35.14 g/L，分別是單獨使用葡萄糖和甘油作為碳源的1.43和1.17倍[10]。PEN等[11]開發(fā)出一種基于魚粉和玉米漿作為有機氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，不僅提高了菌絲體的耐酸能力，而且促進了菌體的生長和ε-PL的合成，使得Streptomycessp.M-Z18的ε-PL產量達到了35.24 g/L，并顯著降低了培養(yǎng)基成本。因此，通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提高ε-PL發(fā)酵產量是一種有效手段。

前期，本團隊通過傳統(tǒng)誘變和抗性篩選手段，獲得1株ε-PL高產突變株S.albulusGS114，其搖瓶ε-PL產量較出發(fā)菌株提高了70%左右。在此基礎上，進一步優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)組分比例和發(fā)酵工藝條件，實現(xiàn)5 L發(fā)酵罐ε-PL發(fā)酵產量達到60.2 g/L，為國內外報道的最高發(fā)酵水平[12-14]。然而，ε-PL發(fā)酵過程中最大菌體量卻達到62 g/L(菌體干重)，造成了發(fā)酵過程需氧量增大，葡萄糖轉化率下降等不良后果，損壞了發(fā)酵過程的經(jīng)濟性。本文以期通過改變有機氮源種類，達到降低菌體量并維持ε-PL發(fā)酵水平，從而實現(xiàn)S.albulusGS114發(fā)酵生產ε-PL過程的高產量和經(jīng)濟性相統(tǒng)一。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

StreptomycesalbulusGS114，由本實驗室選育和保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖，山東西王藥業(yè)有限公司，優(yōu)級純；酵母粉，Oxoid 公司、Biospringer公司、圣琪公司和安琪酵母公司；其他試劑，國藥化學試劑有限公司，分析純。

5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設備有限公司；T&J-Miniskid 1 L×4迷你平行生物反應器，迪必爾生物工程(上海)有限公司；UV-2100分光光度計，優(yōu)尼科儀器有限公司；AB204-N 分析天平，瑞士梅特勒公司；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱，上海光都儀器設備有限公司；高速冷凍離心機3K15，德國西格瑪公司；HYL-C組合式搖床，太倉市強樂設備有限公司；Kjeltec 8400 Analyzer Unit凱氏定氮儀，丹麥福斯分析儀器公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(BTN)(g/L)：葡萄糖10，魚粉蛋白胨2，酵母粉Oxoid 1，瓊脂 20，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(M3G)(g/L)：葡萄糖50，酵母粉Oxoid 5，(NH4)2SO410，K2HPO40.8，KH2PO41.36，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(YP)(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉FM902 14.48，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，KH2PO44，ZnSO4·7H2O 0.04，消泡劑 0.2，pH 6.8。

流加培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖750，氨水 6.25%或12.5%(體積分數(shù))，(NH4)2SO4375，消泡劑100。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取3環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)24 h。

搖瓶水平不同有機氮源的ε-PL發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液以體積分數(shù)8%接種量接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)72 h。

搖瓶水平差異氨基酸添加的ε-PL發(fā)酵：根據(jù)相同質量濃度的FM902與FM760游離氨基酸差異，將質量濃度差異大于15%的氨基酸在濃度相對較小的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加至相應濃度，具體發(fā)酵方式同搖瓶水平不同有機氮源的ε-PL發(fā)酵。

1 L發(fā)酵罐水平不同有機氮源的ε-PL分批發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液以體積分數(shù)8%接種量接入，裝液量700 mL，溫度30 ℃，初始轉速200 r/min，通氣量1 vvm，溶氧設置為30%，轉速溶氧聯(lián)動控制。待pH自然下降至4.0時，用體積分數(shù)6.25%的氨水維持pH恒定4.0直至發(fā)酵結束。

5 L發(fā)酵罐ε-PL的補料分批發(fā)酵：在5 L發(fā)酵罐中裝入3 200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵開始前將初始pH調至6.8，溫度30 ℃，初始轉速200 r/min，通氣量1 vvm，共發(fā)酵192 h。按照8%的接種量將280 mL種子液接入。接種后pH自然下降至6.0時，通過流加體積分數(shù)12.5%氨水維持pH預培養(yǎng)7.5 h。預培養(yǎng)結束后進行pH沖擊，沖擊階段恒定轉速不變，沖擊至溶氧達60%時迅速調至pH 4.0，之后根據(jù)溶氧變化調節(jié)pH，使其盡量維持在10%～30%。當發(fā)酵液中葡萄糖質量濃度低于10 g/L時，根據(jù)葡萄糖的消耗速率設定補料速率，補加質量濃度為750 g/L葡萄糖溶液，維持發(fā)酵液中葡萄糖質量濃度在10 g/L左右直至發(fā)酵結束。與此同時，當NH4+-N質量濃度低于0.2 g/L時脈沖補加375 g/L (NH4)2SO4溶液，使NH4+-N質量濃度維持在0.2～0.5 g/L，如此重復直至發(fā)酵結束。

1.2.2 分析方法

發(fā)酵過程參數(shù)測定：ε-PL濃度測定采用甲基橙比色法[15]。NH4+-N 濃度測定采用靛酚藍反應法[16]。葡萄糖濃度使用生物傳感分析儀(SBA-40C)進行測定[17]。總氮含量測定采用凱氏定氮法[18]。菌體干重的測定參照刁文嬌[19]的方法。

2 結果與討論

2.1 搖瓶水平不同有機氮源對ε-PL發(fā)酵的影響

選取魚粉蛋白胨、羽毛粉、FP103、FP320、FM760、FM408、FM502、FM803、YP600、YP601、Oxoid等11種有機氮源，并以原先使用的酵母粉FM902作為對照，控制其他有機氮源總氮含量與FM902相同，對12種有機氮源的ε-PL發(fā)酵水平進行評估，搖瓶發(fā)酵結果如表1所示。以魚粉蛋白胨、羽毛粉、FM803、FP320、YP600和YP601作為有機氮源，ε-PL產量均在2 g/L以下，顯著低于對照(FM902)。可能的原因是上述6種有機氮源均為遲效有機氮源，它們的有機氮主要以大分子蛋白形式存在，不利于ε-PL的合成。有機氮源FM760和FM408的ε-PL產量分別達到(2.60±0.02)和(2.58±0.08) g/L，較對照FM902提高了22.07%和21.13%。從單位菌體合成能力上看，除FM803、YP601和YP600外，其他8種有機氮源的單位菌體合成能力均顯著高于對照FM902。綜合考慮ε-PL產量和單位菌體ε-PL合成能力，有機氮源FP103、FM760和FM408均優(yōu)于對照FM902。上述3種有機氮源均為酵母浸粉，其加工工藝是以酵母為原料，經(jīng)自溶、酶解、濃縮、干燥等工藝制成，富含蛋白質、氨基酸、肽、多肽、核酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分，屬于速效有機氮源，更加適合S.albulusGS114的ε-PL合成。

表1 不同有機氮源含氮量、添加量及發(fā)酵結果Table 1 Contents, concerntration, and fermentation results of different organic nitrogen sources

2.2 1 L發(fā)酵罐水平不同有機氮源對ε-PL分批發(fā)酵的影響

為進一步確定有機氮源種類，并考慮到pH值是影響ε-PL生物合成的最關鍵因素，故利用1 L發(fā)酵罐在pH 4.0條件下，評估了12種有機氮源分批發(fā)酵生產ε-PL的情況。由圖1-a可知，利用FM760、FM408、羽毛粉、FM502、Oxoid和FP320作為有機氮源發(fā)酵生產ε-PL，分批發(fā)酵ε-PL產量較對照FM902分別提高了42.62%、28.37%、19.37%、16.57%、19.88%和20.22%。有機氮源FM502和YP601實現(xiàn)最大菌體干重達到29.45和29.50 g/L，較對照FM902分別提高了28.32%和28.54%。從圖1-b可知，以FM760、FM408、FM502、YP601和Oxoid為有機氮源的分批發(fā)酵，ε-PL產率較對照FM902分別提高了28.57%、14.29%、21.43%、7.14%和2.35%，達到了0.18、0.16、0.17、0.15和0.14 g/(L·h)。然而，從圖1-c可知，僅有以FM760、FM408、Oxide和FP302為有機氮源的發(fā)酵，葡萄糖轉化率較對照FM902有所提高，其中FM760的葡萄糖轉化率最高(11.93%)，提高了39.53%。從圖1-d可知，除FM502、YP601和YP600外，其他有機氮源的分批發(fā)酵，單位菌體合成能力均較對照FM902(0.20 g/g)有所提高。綜合搖瓶和1 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的結果，可以確定有機氮源FM760是S.albulusGS114發(fā)酵生產ε-PL的最佳選擇。

a-ε-聚賴氨酸與菌體干重；b-產率；c-葡萄糖轉化率；d-單位菌體合成能力圖1 不同有機氮源對ε-PL分批發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different types of organic nitrogen sources in the batch fermentation of ε-PL

2.3 最佳有機氮源FM760促進ε-PL發(fā)酵效率提升的關鍵氨基酸分析

為從氨基酸角度解釋有機氮源FM760較對照FM902提升ε-PL發(fā)酵效率的原因，本研究將相同質量濃度的有機氮源FM760和FM902分別進行了游離氨基酸和水解氨基酸種類及含量的測定，由于2種酵母粉溶于水中呈酸性，且大部分的發(fā)酵時間發(fā)酵環(huán)境處于酸性，天冬酰胺、谷氨酰胺以及色氨酸在酸性條件下被破壞，無法被檢測，故檢測了其余17種常見氨基酸。在游離氨基酸含量方面(圖2-a)，除了天冬氨酸、丙氨酸和半胱氨酸外，F(xiàn)M760其余的游離氨基酸含量均高于對照FM902，其中甘氨酸含量是對照組的4.8倍，但丙氨酸只有FM902的84.51%；在水解氨基酸方面(圖2-b)，2種有機氮源的大部分氨基酸含量均無顯著差異，只有FM760的甘氨酸含量較FM902高出82%，丙氨酸與半胱氨酸分別低了20.02%與81.81%。2種有機氮源的水解氨基酸總量基本一致(圖2-c)，而FM760的游離氨基酸總量較FM902高出33.08%。因此，F(xiàn)M760擁有更加豐富的游離氨基酸，有助于菌體生長和代謝，進而有利于ε-PL合成。

a-游離氨基酸；b-水解氨基酸；c-氨基酸總量；d-搖瓶發(fā)酵結果圖2 FM760與FM902氨基酸比較以及搖瓶發(fā)酵結果Fig.2 Comparison of amino acids between FM760 and FM902 and shake flask fermentation results

綜上，有機氮源FM760促進ε-PL合成的原因很可能與這些差異氨基酸的含量有關。為進一步確認造成2種有機氮源的ε-PL發(fā)酵效率差異，本研究將上述分析中差異較大的氨基酸(質量濃度差異大于15%)，在質量濃度較少的有機氮源中進行外源添加發(fā)酵，結果如圖2-d所示。當FM902中添加甘氨酸，ε-PL產量無明顯變化；當FM760中添加天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，ε-PL產量均有所上升，其中添加了天冬氨酸的ε-PL產量提高幅度最大(7.2%)；而當FM760中添加丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，ε-PL產量均表現(xiàn)出下降，其中添加了異亮氨酸的ε-PL產量下降幅度最大(10.9%)，接近FM902的ε-PL產量。因此，有機氮源FM760提升ε-PL發(fā)酵效率很可能與異亮氨酸有關，其次與丙氨酸和亮氨酸有關。

2.4 不同含量FM760對ε-PL補料分批發(fā)酵的影響

由2.1可知，按照總氮相同的原則，F(xiàn)M760的質量濃度為9.27 g/L，為確定此濃度是否為最佳濃度，分別考察了3個質量濃度梯度(4.27、9.27和14.27 g/L)對補料分批發(fā)酵條件下菌體生長和ε-PL產量影響。當FM760質量濃度為9.27 g/L時，ε-PL產量達到了62.38 g/L，較FM902(52.51 g/L)提高了18.80%(圖3-a)；最大菌體干重達到了55.52 g/L，較對照(48.31 g/L)提高了20%(圖3-b)；單位菌體ε-PL合成能力達到了1.12 g/g，較對照提高了2.75%(圖3-c)；葡萄糖轉化率達到了9.76%，較對照提高了25.77%(圖3-d)，顯示出選擇9.27 g/L FM760作為有機氮源不僅能夠獲得超過60 g/L的ε-PL產量，還可以顯著提高底物轉化率，實現(xiàn)了發(fā)酵產量和發(fā)酵經(jīng)濟性統(tǒng)一。當FM760質量濃度下降至4.27 g/L時，ε-PL產量大幅下降，只有46.24 g/L，原因可能是有機氮源不足導致了菌體未能正常生長，限制了ε-PL的產生。而當FM760質量濃度提高至14.27 g/L時，ε-PL產量達到了67.02 g/L，但是菌體量達到了73.24 g/L，且在發(fā)酵中出現(xiàn)了供氧不足現(xiàn)象。因此，有機氮源FM760的最佳使用質量濃度為9.27 g/L。

a-ε-聚賴氨酸;b-菌體干重;c-單位菌體合成能力;d-葡萄糖轉化率圖3 不同含量FM760對ε-PL補料分批發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different concentrations of FM760 in the fed-batch fermentation of ε-PL

在發(fā)酵過程中監(jiān)控了不同濃度FM760發(fā)酵過程中發(fā)酵液中17種游離氨基酸的變化情況，結果如圖4所示。在發(fā)酵前24 h，菌體處于對數(shù)生長期，17種氨基酸均迅速被消耗至較低水平。在剩余發(fā)酵時間內，谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和L-賴氨酸含量均處于較低水平，但會有一定上升趨勢，這可能和有機氮源中的大分子蛋白或多肽水解有關。值得注意的是，異亮氨酸濃度在發(fā)酵的大部分時間幾乎為零且未有上升趨勢，可能意味著異亮氨酸是限制發(fā)酵過程中菌體生長或ε-PL合成的因素。丙氨酸與亮氨酸在發(fā)酵中期的含量有上升趨勢，并在發(fā)酵后期降至低水平。ZHEN等[20]發(fā)現(xiàn)丙氨酸的添加會增加細胞內活性氧的產生，而本團隊前期研究表明高水平活性氧會導致生產菌氧化損傷，進而影響ε-PL的合成[12]；支鏈氨基酸亮氨酸會產生代謝反饋抑制[21]，一定程度上抑制了中間體丙酮酸的產生，影響ε-PL的產生。結合2.3中的差異氨基酸添加的實驗結果，較低含量的亮氨酸與丙氨酸可能更有利于ε-PL合成，但需要進一步實驗驗證。

圖4 不同含量FM760對ε-PL發(fā)酵過程中胞外游離氨基酸的影響Fig.4 Effect of different concentrations of FM760 on the extracellular free amino acids during ε-PL fermentation

3 結論

本研究通過對有機氮源種類及含量進行系統(tǒng)的優(yōu)化，最終從11種常見有機氮源中篩選出了一種最佳有機氮源——酵母浸粉FM760，最佳添加質量濃度為9.27 g/L。利用此有機氮源，在搖瓶自然發(fā)酵中，ε-PL產量達到(2.60±0.02) g/L，較對照提高22.07%；在分批發(fā)酵中，ε-PL產量達到(6.41±0.23) g/L，較對照提高42.64%；在補料分批發(fā)酵中，ε-PL產量達到了62.38 g/L，相比于對照提高了18.80%，葡萄糖轉化率也提高了25.77%。通過分析FM760中氨基酸組成并結合氨基酸添加實驗，初步確定了FM760提高ε-PL產量可能與異亮氨酸、亮氨酸與丙氨酸含量有關，結果與廖麗娟等[22]研究相似。下一步，將圍繞3種氨基酸單獨或協(xié)同對ε-PL合成的影響，進一步揭示其促進ε-PL產量提高的原因。該研究結果對工業(yè)發(fā)酵生產ε-PL的有機氮源選擇具有重要指導意義。