海洋桿菌糖基轉移酶Agt突變體的制備及其在單葡萄糖甘油二酯催化合成中的應用

張志平，趙雨哲，趙彩夢，楊旭，魏濤

(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001)

甘油糖脂是糖與1, 2-二酰基-sn-甘油通過糖苷鍵連接而成的化合物，其單糖或寡糖附著在甘油主鏈的sn-3位置，主要存在于海藻[1-3]、藍細菌[4-6]及高等植物中。單葡萄糖甘油二酯(monoglucosyl diacylglycerol，MGlc-DAG)、1, 2-二酰基-3-O-β-D-吡喃型半乳糖基-甘油(monogalactosyldiacylglycerol，MGDG)、1, 2-二酰基-3-O-(α-D-吡喃型半乳糖基(1→6)-O-β-D吡喃型半乳糖基)-甘油(digalactosyldiacylglycerol，DGDG)和1, 2-二酰基-3-O-(6-脫氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖基)-甘油(sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)是海洋藍藻和葉綠體中常見的4種甘油糖脂[7]。在其他細菌中也發現了多種甘油糖脂，在這些甘油糖脂中，糖供體(除了半乳糖和葡萄糖)主要以α-或β-異聚體的形式結合在(1→2)，(1→3)，(1→4)或(1→6)鏈中[8]。此外，從天然產物中鑒定出一些獨特類型的甘油糖脂，包括氨基甘油糖脂[9]、醚鍵甘油糖脂[10]和葡萄糖醛酸甘油脂[11]。甘油糖脂具有多種生物活性和藥理活性，如抗腫瘤[12-13]、抗氧化[14]、抗病毒[15]和抗炎[16]等，可廣泛應用于制藥工業，已成為業界研究熱點。

常見的植物提取方法為Floch液-液萃取法，該方法使用有機溶劑氯仿/甲醇進行萃取[17]，操作步驟較為繁瑣，所提取的產物中甘油糖脂含量少、純度低、雜質(中性脂、游離脂肪酸和磷脂等)多[18]。化學合成法對反應條件和分離設備要求高，副產物較多，目標產品不易分離，產生的廢液污染性強。生物酶法制備甘油糖脂，具有反應步驟較少，轉化率高、純度高等優勢，有良好的工業應用前景。根據已有文獻報道和課題組前期研究，海洋桿菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211中的糖基轉移酶Agt具有催化合成不同甘油糖脂活性，其中以二磷酸尿苷-葡萄糖(uridine diphosphate gluscose,UDP-Glu)和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯的活性最高；生物信息學分析結果也表明保守絲氨酸Ser257與酶和底物結合活性有關[19-20]。因此本文嘗試構建海洋桿菌糖基轉移酶Agt突變體，獲得高活性突變體酶，進而研究以UDP-Glu和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯，以期為甘油糖脂合成新方法和工業化應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質粒

海洋桿菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211，感受態細胞EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL，克隆與表達載體pET15b和重組質粒pET15b/Agt，均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

dNTP、ProbestTMDNA聚合酶、限制性內切酶NdeI及SalI，日本寶生物(大連)公司；DNA連接試劑盒kit ver.2.1、細菌基因組DNA提取試劑盒kit ver.3.0，TaKaRa公司；氨芐青霉素、氯霉素、咪唑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、甘氨酸(電泳級)，美國BBI公司；蛋白Marker，美國Thermo Scientific公司；Ni-NTA 瓊脂糖，Qiagen公司；UDP-Glu、甘油二酯(diacylglycerol，DAG)、MGlc-DAG、MGDG，美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；J6-MI型超低溫離心機，美國Beckman公司；JY92-II DN型超聲波細胞粉粹機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JB-680B型全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；UV-2006型紫外可見分光光度計，上海儀器有限公司；德國默克硅膠板60，北京豐美天合科技有限公司；瑞士CAMAG自動TLC取樣器Ⅲ，上海艾研生物科技有限公司；TLC Scanner 4型CAMAG薄層色譜掃描儀，上海智巖科學儀器有限公司；CMax Plus型SpectraMax微孔讀板機，北京五洲東方科技發展有限公司；Agilent Technologies 1290 Infinity II UPLC型超高效液相色譜，美國Agilent公司；AB SCIEX Triple QuadTM 5500型質譜儀，AB SCIEX公司；Nanodrop 2000型微量紫外分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基轉移酶Agt突變體重組質粒的構建

前期利用生物信息學和蛋白質結構模擬分析發現，C.pelagibactersp.HTCC7211糖基轉移酶Agt和其同源物中，氨基酸殘基Ser257為高度保守位點，可能與底物UDP-Glu和甘油二酯結合有關，本研究嘗試構建糖基轉移酶Agt點突變體(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)[19-20]，具體方法如下：使用重疊延伸PCR法構建糖基轉移酶Agt突變體質粒，以pET15b/Agt重組質粒為模版，設計上下游引物(表1)進行突變片段PCR，將突變基因片段重新克隆到pET15b載體中以獲得突變體重組質粒。PCR反應體系(50 μL)為：模板1 μL(25 ng)，dNTP (25 mmol/L)2 μL，引物(100 μmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10×緩沖液 5 μL，ProbestTMDNA聚合酶 (5U/μL)1 μL，超純水37 μL。第一輪PCR反應模板為質粒pET15b/Agt，第二輪PCR反應模板為第一輪PCR產物。具體PCR反應條件為：第一輪：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環。第二輪：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環。

表1 糖基轉移酶Agt突變體構建上下游引物Table 1 Synthetic oligonucleotide primers used for construction of glycosyltransferase Agt

1.2.2 野生型糖基轉移酶Agt及其突變體基因的誘導表達和純化

將野生型糖基轉移酶Agt基因質粒與上述合成的突變體重組質粒分別轉化到E.coliBL21-codonPlus(DE3)-RIL中，取單菌落在已加入100 mg/L氨芐青霉素及34 mg/L氯霉素的LB培養基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L)中培養，當OD600達到0.4～0.6時，加入0.5 mmol/L IPTG誘導表達，10 h后收集菌體，經離心后超聲破碎，收集上清液，隨后采用鎳柱親和層析(洗脫緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，500 mmol/L NaCl, 300 mmol/L 咪唑, 1% Triton X-100)和Superdex-200(16/60)凝膠過濾柱(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，200 mmol/L NaCl；洗脫速度0.5 mL/min)進行純化，得到野生型糖基轉移酶Agt以及重組突變體酶，使用SDS-PAGE法檢測純化后的目標蛋白。

1.2.3 野生型Agt與突變體酶活性分析

以UDP-Glu和甘油二酯為底物，不含有酶的反應體系作為空白對照組，野生型Agt與突變體酶作為實驗組進行酶活性分析。酶活力標準反應體系(1 mL)為：0.1 mmol/L UDP-Glu、0.1 mmol/L甘油二酯、2.0 μmol/L純化蛋白和50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)反應緩存液[19-20]。將反應體系于35 ℃恒溫下200 r/min恒定孵育20 h，采用Floch法以V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2提取反應產物，并使用薄層層析TLC法分離反應產物，隨后使用液質聯用LC-MS方法檢測反應產物。酶活力單位的定義：一個酶活力單位為在標準條件下每分鐘催化合成1 μmol的單葡萄糖甘油二酯所需的酶量。

1.2.4 反應產物甘油糖脂的分離提取

采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2和V(環己烷)∶V(乙酸乙酯)分別為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6復提反應產物。具體操作流程如下：取1 mL酶催化所得反應產物，加入1 mLV(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2劇烈振蕩45 s后于3 000 r/min離心5 min，提取液分層后，糖脂溶于下層有機相中，收集下層有機相。將上層溶液加入V(環己烷)∶V(乙酸乙酯)分別為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6溶液中重新提取，合并2次提取樣品，得到反應產物。按公式(1)計算提取率：

(1)

1.2.5 薄層層析方法分析檢測反應產物

使用CAMAG自動TLC取樣器III對提取的糖脂進行薄層層析(thin layer chromatography，TLC)分析。在硅膠板60上用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶35∶4進行分離，并用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10進行染色，觀察合成的糖脂化合物。

1.2.6 液質聯用(LC-MS)方法分析檢測反應產物

將TLC檢測后獲得的糖脂產物溶解于有機溶劑[V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(乙腈)=6∶3∶1]中，采用LC-MS檢測產物結構。使用BEH Amide XP色譜柱(內徑2.5 μm，3 mm×150 mm，Waters，USA)進行色譜分離。LC-MS檢測流動相為溶劑A-乙腈，溶劑B-pH 9.2的10 mmol/L乙酸銨。進樣前先使用V(溶劑A)∶V(溶劑B)=95∶5平衡色譜柱10 min，15 min后，使用從V(溶劑A)∶V(溶劑B)=95∶5到V(溶劑A)∶V(溶劑B)=70∶30逐步梯度進行分離，恒定流速為150 μL/min。質譜分析條件為：ESI正離子模式，離子噴霧電壓3 500 V，溫度350 ℃。霧化器氣體以及加熱器氣體40 psi。

1.2.7 糖基轉移酶Agt突變體酶最適反應條件分析

1.2.7.1 最適酶濃度確定

以UDP-Glu和甘油二酯為底物，分別加入不同濃度的突變體酶進行反應，測定單葡萄糖甘油二脂的產量。

1.2.7.2 最適底物濃度確定

在最適酶濃度作用下，分別加入不同濃度的UDP-Glu作為底物進行反應，測定單葡萄糖甘油二脂的產量。

1.2.7.3 最適反應溫度確定

在最適酶濃度和底物濃度條件下，以Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.5)為緩沖體系，將一定量的突變體酶與底物分別于10～50 ℃條件下反應(溫度梯度為5 ℃)，在水浴振蕩24 h后，測定突變體酶的酶反應活力。

1.2.7.4 最適反應pH確定

使用50 mmol/L的不同pH(6.0～11.0)緩沖體系：磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.5)和3-(環己胺)-1-丙磺酸(CAPS，pH 9.5～11.0)，將一定量酶加入到上述不同pH緩沖液中反應1 h，分別測定酶活力。

1.2.7.5 最適反應條件下突變體酶催化合成單葡萄糖甘油二酯的反應

在上述確定的突變體酶各項最適條件下進行催化反應，測定催化產物單葡萄糖甘油二酯的產量，計算轉化率。

2 結果與分析

2.1 野生型糖基轉移酶Agt及其突變體酶的表達

海洋桿菌C.pelagibactersp.HTCC7211糖基轉移酶Agt及其突變體酶(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)重組質粒在E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL表達后，經鎳柱親和層析和分子篩Superdex-200(16/60)凝膠過濾柱，獲得純化后的突變體酶，SDS-PAGE電泳分析表明，突變體酶的分子質量約為38 kDa(圖1)。

M-蛋白Marker；1-全蛋白；2-上清蛋白；3-純化后的糖基轉移酶Agt；4-8-分別為純化后的突變體酶(T257A、T257I、T257S、T257D以及T257K)圖1 純化后的野生型糖基轉移酶Agt及其突變體酶的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type control

2.2 野生型糖基轉移酶Agt及其突變體酶動力學分析

kcat/Km值是衡量酶催化效率的重要參數，通過測定不同突變體的kcat/Km值，進而表征酶催化效率的變化情況。以UDP-Glu及甘油二酯為底物，對比分析野生型糖基轉移酶Agt及其突變體酶的動力學常數，結果如表2所示。突變體T257S的kcat/Km值為(111.9±1.9) L/(mmol·min),是野生型酶Agt(71.4±2.7) L/(mmol·min)的1.56倍，由此可知突變體T257S催化效率相對于野生型酶Agt顯著提高；其他突變體T257A、T257I、T257D和T257K催化合成單葡萄糖甘油二酯效率均有所降低。推測原因，突變體T257S突變的位點可能有效改變酶的活性中心微環境，與Thr相比，Ser缺少一個亞甲基，因此Ser殘基與底物之間可能會有更多的結合空間，利于Ser殘基與糖供體UDP-Glu間的相互作用[21-22]。上述結果表明，與野生型酶Agt相比，突變體T257S具有更高的催化活性和催化效率，因此，選用突變體T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯。

表2 野生型糖基轉移酶Agt與突變體酶動力學參數分析aTable 2 Kinetic parameters of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type controla

2.3 突變體酶T257S反應產物提取方法的優化結果

甘油糖脂常采用Floch液-液萃取法，選用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2為提取液，然而，該方法所提產物中含有一定量的中性脂、游離脂肪酸和磷脂等雜質，往往需要進一步采用薄層色譜法/固相萃取/高效液相色譜法等來分離純化[17-18]。本文研究了傳統氯仿/甲醇法與不同體積比環己烷/乙酸乙酯重復提取的效果，各種方法對T257S反應產物提取率的比較結果如圖2所示。結果表明，單采用氯仿/甲醇法的提取率僅為42.2%，而通過環己烷/乙酸乙酯復提后的產物提取率均有所提高，特別是采用V(環己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4復提后，產物提取率可達84.7%。因此V(環己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4復提產物的得率約是單純采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2法的2倍。

圖2 對比分析環己烷/乙酸乙酯和氯仿/甲醇方法提取反應產物Fig.2 Comparative analysis of reaction products extracted by the methods cyclohexane/ethyl acetate and chloroform/methanol

2.4 TLC方法分離T257S反應產物

TLC能夠分離、定性分析出多種新的糖脂。對有機萃取獲得的高純產物進行薄層色譜分析，結果如圖3所示，使用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10染色后，對照標準品可知，實驗組均為單條帶，反應產物為單葡萄糖甘油二酯，表明突變體酶T257S可以利用UDP-Glu和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯。

1-單葡萄糖甘油二酯和MGDG標品；2-未加酶的對照組；3,4-加入突變體酶后的催化合成產物圖3 糖基轉移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯的TLC結果Fig.3 TLC results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.5 LC-MS法檢測T257S反應產物

采用LC-MS法進一步鑒定甘油糖脂結構。在正離子掃描模式下檢測結果如圖4所示，突變體酶T257S催化反應產物中獲得單葡萄糖甘油二酯的特征碎片圖譜，甘油二酯為m/z577.4、甘油單酯(甘油-16∶0)為m/z313.3，甘油單酯(甘油-18∶1)為m/z339.3，單葡萄糖甘油二酯母離子為m/z774.3。進一步證明了糖基轉移酶突變體T257S合成產物為單葡萄糖甘油二酯，具體生物催化反應式見圖5。

圖4 糖基轉移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯的二級質譜結果Fig.4 Secondary mass spectrometry results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

圖5 糖基轉移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯催化反應式Fig.5 Reaction scheme for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6 糖基轉移酶突變體T257S最適反應條件分析

2.6.1 突變體酶最適酶濃度和最適底物濃度

突變體酶最適酶濃度及底物濃度見圖6。

圖6 糖基轉移酶Agt突變體T257S的最適反應酶濃度(a)和底物質量濃度(b)Fig.6 Optimal enzyme concentration (a) and substrate concentration (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

由圖6-a可以看出，單葡萄糖甘油二酯在糖基轉移酶突變體T257S酶濃度為8 U/mL時產率最高；由圖6-b可以得出，單葡萄糖甘油二酯在底物UDP-Glu質量濃度為500 mg/L時產率最高。

2.6.2 突變體酶最適反應溫度和最適反應pH

如圖7-a所示，隨著溫度的升高，酶活性也逐漸提高，當反應溫度到達35 ℃時，突變體酶T257S活性最高，溫度超過35 ℃酶活性逐漸降低，因此突變體酶T257S的最適反應溫度為35 ℃。如圖7-b所示，當pH在8.5時，突變體T257S的相對酶活性較高，因此突變體酶T257S最適反應pH為8.5。

圖7 糖基轉移酶Agt突變體T257S的最適溫度(a)和最適反應pH(b)Fig.7 Optimal temperature (a) and pH (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6.3 最適反應條件下突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯的反應

突變體酶T257S合成單葡萄糖甘油二酯的最佳反應條件為：酶濃度8 U/mL、UDP-Glu質量濃度500 mg/L、溫度35 ℃和pH 8.5。最佳條件下反應20 h，突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯的結果如圖8所示。突變體酶T257S在反應8 h后以68.5%的轉化率合成單葡萄糖甘油二酯(424.5 mg/L)；在初始500 mg/L的反應中，酶在8 h內消耗的UDP-Glu為365 mg/L(0.59 mmol/L)，根據轉化化學計量法，理論生成單葡萄糖甘油二酯應為452.2 mg/L，轉化率為68.5%。單葡萄糖甘油二酯在反應溶液中隨時間分解，表明產物不穩定且可能易氧化。整個反應過程中，單葡萄糖甘油二酯的損失量約為27.7 mg/L，進而計算得出反應生成單葡萄糖甘油二酯純度為93.8%，表明突變體酶T257S具有較高的催化UDP-Glu和甘油二酯合成單葡萄糖甘油二酯的活性，可作為生物技術應用中酶轉化合成單葡萄糖甘油二酯的備選酶源。

圖8 最適反應條件下突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯Fig.8 The synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt under optimal reaction conditions

3 結論與討論

甘油糖脂具有抗腫瘤、抗病毒和抗炎等生物活性，相關研究已經引起人們的廣泛關注。本研究在前期發現海洋細菌C.pelagibactersp.HTCC7211中一個高效催化合成單葡萄糖甘油二酯的甘油糖脂合成酶Agt的基礎上，對該酶進行分子改造，構建了系列突變體酶表達質粒，并成功實現了宿主表達；相對于野生型甘油糖脂合成酶Agt，突變體T257S的催化效率顯著提高；進一步采用傳統氯仿/甲醇法結合環己烷/乙酸乙酯復提產物，有效提高了產品提取效率；在確定突變體酶最佳反應條件的基礎上，反應產物單葡萄糖甘油二酯純度可達93.8%。本研究為國內外首次采用生物酶法成功制備高純度的單葡萄糖甘油二酯。

綜上所述，通過C.pelagibactersp.HTCC7211中的甘油二脂合成酶Agt基因構建并表達的單葡萄糖甘油二酯合成酶突變體T257S具有較高的生物催化活性，可高效催化UDP-Glu和甘油二酯合成高純度單葡萄糖甘油二酯，適用于單葡萄糖甘油二酯生物酶法制備，具有較高的研究價值及廣泛的工業應用前景。