重組大腸桿菌產鹵代烷脫鹵酶的發酵條件優化

名曉東，郭自濤，陳劍雄，顧正華，辛瑜，孫海彥，關彥明，張梁*

1(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口，571101)3(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)

工農業生產過程中會產生大量的鹵代化合物，這些化合物具有高毒性、持久性以及生物濃縮性，對人類健康以及生態環境構成了巨大的危害[1-2]。傳統的化學消解、焚燒等處理方法在處理過程中會產生新的有毒副產品。同時，這些化學試劑大多屬于有毒試劑，使用時或使用后會產生新的環境污染問題。因此，迫切需要開發安全、綠色的處理方法[3]。生物酶處理法具有溫和、環保、無毒、無腐蝕的特點，逐漸成為治理環境污染物的研究熱點。

鹵代烷脫鹵酶(EC3.8.1.5，HLDs)是一類能夠催化鹵代烷烴化合物碳-鹵鍵斷裂的水解酶，可以將底物轉化為相應的醇、鹵素離子與質子，整個酶促反應過程中僅需水作為唯一的輔助因子，不需要輔酶/輔基或者氧的參與[4]。此外，其底物譜比較廣泛，可以催化氯代、溴代、碘代烷烴、環烷烴、酯、醚、環氧化物等化合物的水解[5]。基于其底物的多功能性，HLDs在多種領域具有應用潛力，例如工業催化、環境污染物的降解、化學過程副產品的回收、環境污染物的生物傳感以及蛋白分析與分子成像等[4,6-8]。DhaA是最具有代表性的鹵代烷烴脫鹵酶之一，該基因最早從RhodococcusrhodochrousNCIMB 13064中分離出來[9]，DhaA不僅對工業副產品三氯苯酚有降解作用[10]，同時對糜爛性毒劑芥子氣也有一定的降解作用[11]。然而，其廣泛的應用目前主要受限于酶的穩定性與產量方面[12]。目前，對于此酶的研究主要通過定點突變提高酶的催化效率及熱穩定性[13-15]；通過固定化的手段提高酶的溫度、pH、金屬離子、有機溶劑耐受性以及儲藏穩定性[16-18]。然而，對于提高其表達量的研究較少。因此，在提升其穩定性的同時，提高酶的表達量將促進其生產應用。

本研究中，對已構建好的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA在搖瓶中進行發酵培養基與發酵工藝的優化，并在5 L發酵罐中進行了工藝放大驗證。本研究將為DhaA的進一步放大生產奠定基礎，同時也將為其他種類HLD的發酵生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA,本實驗室保存。

1.1.2 培養基

種子培養基(LB)(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

基礎培養基(TB)(g/L)：甘油5，酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31, K2HPO412.54。

發酵培養基(g/L)(pH 7.0)：甘油10，酵母粉23，蛋白胨14，MgSO4·7H2O 1.3，ZnSO4·7H2O 0.1。

1.2 實驗儀器

JY92-IIDN超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；T&J Atype 5 L玻璃發酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；V-1200可見分光光度計，上海美普達儀器公司；MQD-B3R搖床，上海旻泉儀器有限公司；Spark全自動酶標儀，TECAN公司；數顯恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子活化

將保存于-70 ℃冰箱的菌種在固體LB培養基進行劃線，在37 ℃恒溫培養箱培養14～16 h；挑取單菌落于裝有15 mL LB培養基的50 mL三角瓶中37 ℃培養12～13 h作為一級種子液；按2%(體積分數，下同)接種量接種于裝有50 mL LB培養基的250 mL三角瓶中培養9 h(對數中后期)作為二級種子液。

1.3.2 粗酶液的收集

將發酵后的菌體轉移至離心管進行收集，使用0.1 mol/L的Gly-NaOH(pH 8.6)緩沖液將菌體洗滌2遍后進行超聲破碎。破碎完畢離心去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。

1.3.3 酶活力的測定

酶活力定義：在一定條件下，1 min催化底物產生1 μmol Cl-所需的酶量定義為1個酶活力單位。

酶活力測定方法：雙(2-氯乙基)醚作為底物，總反應體系500 μL，緩沖液為0.1 mol/L Gly-NaOH，底物的終濃度為10 mmol/L，加酶量為10 μL粗酶液。40 ℃反應20 min后，吸取200 μL加入裝有20 μL 30%(體積分數)HNO3離心管中終止反應，之后加入55 μL Hg(SCN)2溶液和110 μL NH4Fe(SO4)2溶液，混勻靜置10 min后取200 μL加入96孔板中，使用酶標儀測量在460 nm下的吸光度[16,19]。

1.3.4 SDS-PAGE

將發酵取樣的菌體濃度稀釋至同一水平，0.1 mol/L的Gly-NaOH(pH 8.6)緩沖液洗滌2遍后進行超聲破碎，離心去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。取20 μL的上清液，加入5 μL上樣緩沖液，沸水浴10 min后，離心，上樣量均為10 μL。電泳結束后，進行染色脫色處理。

1.4 初始培養方法

以2%接種量將二級種子液接種于50 mL基礎培養基中(250 mL三角瓶)，37 ℃培養至OD600=0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)25 ℃誘導13 h。

1.5 培養基優化

1.5.1 單因素實驗

以OD600與酶活力為指標，依次以碳源種類、碳源濃度、氮源種類、氮源濃度、磷酸鹽濃度、無機鹽種類、無機鹽濃度、金屬離子種類以及金屬離子濃度為影響因素進行單因素實驗。

1.5.2 Plackett-Burman(PB)實驗

在單因素的基礎上進行PB實驗設計，對培養基成分進行關鍵因素的篩選，各因素選取2個水平，高水平為低水平的1.5倍，以酶活力作為實驗響應值進行實驗。實驗水平設計見表1。

表1 PB實驗設計的因素與水平 單位：g/LTable 1 Factors and levels of PB experimental design

1.5.3 Box-Behnken實驗

以PB實驗篩選出的3個顯著影響因素(酵母粉濃度、蛋白胨濃度、MgSO4·7H2O濃度)為實驗因素進行Box-Behnken實驗設計，各因素設置3個實驗水平，以酶活力作為響應值。實驗水平設計見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計的因素與水平 單位：g/LTable 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.6 搖瓶發酵條件優化

在優化的最佳培養基的基礎上，對發酵條件中的誘導時機、接種量、誘導溫度、誘導劑濃度、裝液量進行優化。

1.7 發酵罐驗證

分批發酵：5 L發酵罐中，2.5 L的初始裝液量，接種量為5%。接種前加入一定量的卡那霉素，使其終質量濃度為50 mg/L，通氣比為1 vvm，溶氧為30%，溶氧與轉速進行偶聯，pH 7.0，使用10%(體積分數)硫酸與50%(體積分數)氨水進行pH的調控。37 ℃培養4 h后，溫度降至20 ℃，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導。

補料分批發酵：在分批發酵的基礎上恒速流加50%(體積分數)的甘油，溶氧反彈作為流加甘油的標志。

1.8 數據處理

所有實驗均重復3次，實驗數據均用平均值±標準差表示。應用Excel 2013和Design-Expert 8.0.6進行數據分析，并使用Origin 2019作圖。

2 結果與討論

2.1 培養基優化

2.1.1 單因素實驗

(1)培養基碳源的優化

以相同質量濃度的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、糊精、蔗糖、淀粉替換基礎培養基的甘油，誘導13 h后測定菌體濃度與酶活力，不同碳源對重組菌的生長與產酶情況如圖1-a所示。以甘油作為碳源時，菌體的酶活力最大，達到(610.44±4.16) U/L。雖然葡萄糖是常見的速效碳源，適合菌體的生長，但總產酶水平與單位菌體產酶水平均比甘油效果差，這可能是由于葡萄糖會降低含有Lac啟動子重組菌胞內的cAMP水平，對誘導物的利用有抑制作用，進而會降低其產酶水平[20]。并且，考慮到葡萄糖的快速利用容易產生大量乙酸，抑制菌體生長與產物的形成[21]，因此選擇甘油作為最適碳源。碳源濃度對酶活力的影響如圖1-b所示，隨著碳源濃度的增加，菌體的產酶水平呈現出先增加后降低的趨勢，當甘油添加量達到10 g/L時，菌體的產酶水平最高，達到(592.11±12.98)U/L，因此選擇10 g/L的甘油作為碳源。

a-碳源種類;b-甘油添加量圖1 碳源對發酵的影響Fig.1 Influence of carbon source on fermentation

(2)培養基氮源的優化

以相同質量濃度的酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉、蛋白胨以及硫酸銨代替培養基中的復合氮源，誘導13 h后測定菌體濃度與酶活力。結果如圖2-a所示，相對于單一的氮源成分，復合氮源下的菌體濃度與產酶水平均達到最高，酶活力達到(779.60±18.94) U/L。以無機氮源作氮源時，菌體濃度與產酶水平均為最低，說明無機氮源并不適合菌體的生長與產酶。酵母粉與蛋白胨的復合不僅能夠提供氮源，并且可以提供維生素、礦物質與氨基酸等。同時，酵母粉可以促進重組大腸桿菌將重組酶釋放到周質空間[22]。因此，選擇酵母粉與蛋白胨組成的復合氮源作為最佳氮源。酵母粉與蛋白胨的濃度優化結果如圖2-b和圖2-c所示，最佳的酵母粉與蛋白胨質量濃度分別為20、15 g/L，其對應的產酶水平分別為(812.05±3.75)、(881.28±1.65) U/L。

a-氮源種類；b-酵母粉濃度；c-蛋白胨濃度；d-磷酸鹽濃度圖2 氮源與磷酸鹽對發酵的影響Fig.2 Effects of nitrogen source and phosphate on fermentation

(3)培養基磷酸鹽濃度的優化

搖瓶發酵誘導13 h后測定菌體濃度與酶活力，探究磷酸鹽濃度對菌體產酶的影響。結果如圖2-d所示，磷酸鹽濃度從0～180 mmol/L增加的過程中，對菌體濃度的影響并不大，酶活力出現了先降低后增加再降低的趨勢。不加磷酸鹽時，發酵過程中pH與對照組相比無明顯差異，并且此時的酶活力最高可達到(850.46±21.99) U/L。類似現象在其他酶的發酵優化過程中也有報道，這可能是高濃度磷酸鹽對某些酶的生產有抑制作用[20]。同時，考慮到不添加磷酸鹽可降低廢水的污染，所以培養基中選擇去除磷酸鹽。

(4)培養基無機鹽的優化

無機鹽的主要作用是構成菌體組織成分，參與調節細胞的滲透壓并維持某些酶的活性[23]。在培養基中添加NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、KCl，添加量為1.0 g/L，誘導13 h后測定菌體濃度與酶活力，探究無機鹽對菌體產酶的影響。結果如圖3-a所示，添加MgSO4·7H2O有利于菌體的產酶，酶活力達到(985.67±16.26)U/L。對MgSO4·7H2O的濃度優化，如圖3-b所示，其濃度達到1.0 g/L時產酶最高，達到(1 101.69±38.53)U/L，所以培養基最終選擇添加1.0 g/L的MgSO4·7H2O。

a-無機鹽種類；b-MgSO4·7H2O濃度；c-金屬離子種類；d-ZnSO4·7H2O濃度圖3 無機鹽與金屬離子對發酵的影響Fig.3 Effects of inorganic salts and metal ions on fermentation

(5)培養基金屬離子的優化

在培養基中添加0.1 g/L的ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2促進鹵醇脫鹵酶表達相符。對ZnSO4·7H2O濃度優化如圖3-d所示，當質量濃度達到0.1 g/L時，其酶活力最高可達到(1 085.13±9.00) U/L；當其質量濃度大于0.1 g/L時，菌體濃度與酶活力均有明顯下降，所以最佳質量濃度設置為0.1 g/L。

2.1.2 PB實驗

PB實驗的實驗設計與結果如表3所示，顯著性分析結果如表4所示，模型顯著(P<0.05)，篩選出對發酵產酶有顯著影響的因素依次為酵母粉濃度(B)、蛋白胨濃度(C)、MgSO4·7H2O濃度(D)。

表3 PB實驗結果Table 3 PB test results

表4 PB實驗方差分析Table 4 PB analysis of variance

2.1.3 Box-Behnken實驗

Box-Behnken的實驗結果及預測值如表5所示，顯著性分析如表6所示。此模型達到極顯著水平(P<0.01)，失擬值不顯著(P>0.05)，說明模型擬合度較高。對表5的數據進行回歸擬合可得方程為：Y=1 151.71+62.36X1-16.58X2+19.96X3-95.78X1X2+16.79X1X3+30.78X2X3-151.21X1X1-67.52X2X2-15.70X3X3。該方程的相關系數R2為0.996 0，可用于此菌株發酵產酶的培養基優化分析及預測。

表5 Box-Behnken實驗結果Table 5 Box-Behnken experimental results

表6 Box-Behnken實驗方差分析Table 6 Box-Behnken experimental variance analysis

對響應面的回歸方程、三維響應面圖以及等高線圖分析后得到的最佳配比為酵母粉23 g/L、蛋白胨14 g/L、MgSO4·7H2O 1.3 g/L，酶活力的預測值為1 169.22 U/L。為驗證模型預測的結果，進行了3組平行的實驗，酶活力為(1 182.94±10.86)U/L，實驗結果與模型預測的結果基本符合，比優化前(610.44±4.16)U/L提高了93.78%，脫鹵酶的發酵水平顯著提高。

2.2 搖瓶發酵條件優化

(1)添加誘導劑的時間

異源蛋白表達的啟動會對宿主細胞正常代謝帶來負擔，對菌體濃度、蛋白表達和質粒穩定性都會產生負面影響，過早的誘導不利于菌體的生長，菌體濃度太低，沒有足夠量的菌體來進行蛋白的表達；添加誘導劑時間太晚時，菌體積累的代謝產物較多，菌體趨于老化，其產酶能力減弱，蛋白質的表達通常要使菌體處于一定的生長水平[25]。以優化完的發酵培養基進行發酵條件優化，分別在OD600達到0.6、1.2、1.8、2.6、3.4、4.4、5.6時添加誘導劑，25 ℃誘導13 h后測定菌體濃度與酶活力，如圖4-a所示，當OD600達到1.8時(對數前期)添加誘導劑酶活力最大，達到(1 525.56±10.86)U/L，所以選擇在對數前期進行誘導。

(2)接種量

接種量對于發酵周期與產物合成有著直接影響，合適的接種量縮短延遲期，減少雜菌污染的機會，接種量大時，菌體繁殖快，容易造成溶氧不足，持續生長時間短，自溶也較快，不利于目的蛋白的積累[26]。如圖4-b所示，當接種量為5%時，酶活力達到最大(1 873.22±94.16)U/L，因此，選擇5%為最佳接種量。

(3)誘導溫度

誘導溫度是影響異源蛋白表達的關鍵參數之一。低溫誘導通常可以減少蛋白質的錯誤折疊，但同樣會降低菌體的代謝活動，延長發酵周期，高溫誘導雖然可以加快代謝活動，縮短發酵周期，但同時會由于蛋白質折疊太快出現錯誤折疊，并產生大量的不溶性蛋白(包涵體)[25]。如圖4-c與圖4-d所示，20 ℃誘導22 h的酶活力最大，達到(2 798.22±17.45)U/L。30 ℃誘導的菌體濃度與酶活力均受到抑制，其他重組蛋白的發酵過程中也觀察到類似的現象[27]，可能是由于高溫誘導產生的包涵體對菌體生長和目的蛋白的可溶性表達均有抑制作用。而低于20 ℃的誘導溫度在發酵周期和溫度控制方面均不適合實際生產，所以選擇20 ℃誘導22 h作為最佳條件。

a-誘導時機；b-接種量；c-不同誘導溫度下的菌體生長狀況；d-不同誘導溫度下的菌體產酶狀況圖4 誘導時機、接種量及誘導溫度對發酵的影響Fig.4 Effects of induction time, inoculation amount and induction temperature on fermentation

(4)誘導劑濃度

IPTG可作為基于T7啟動子表達載體的誘導劑[28]，如圖5-a所示。在低濃度時，酶活力隨著IPTG濃度的增加而增加，濃度增加至0.4 mmol/L時，其產酶能力達到閾值，此時的酶活力達(3 372.89±17.03)U/L，由于高濃度的IPTG對菌體有一定的毒性，繼續增加IPTG濃度對菌體濃度與酶活力均有一定抑制作用。因此，以0.4 mmol/L的誘導劑作為最佳誘導濃度。

(5)裝液量

搖瓶發酵過程中的裝液量通過影響發酵液與空氣的接觸面積來影響發酵過程中的溶氧水平，對菌體的生長與蛋白的表達有著重要影響[29]。如圖5-b所示，搖瓶的溶氧水平隨著裝液量的增加而減少，裝液量達到40 mL/250 mL時達到最大酶活(3 585.83±15.02)U/L，繼續增加裝液量則由于供氧不足對菌體生長與蛋白表達均產生了負面影響，所以最終選擇40 mL/250 mL作為最佳裝液量。

a-IPTG濃度；b-裝液量圖5 誘導劑濃度及裝液量對發酵的影響Fig.5 Effect of inducer concentration and liquid loading amount on fermentation

2.3 5 L發酵罐放大實驗

分批發酵結果如圖6-a所示，37 ℃培養4 h后，開始降溫至20 ℃并加入0.4 mmol/L的IPTG進行誘導，酶活力隨著菌體濃度的增加而增加，產物的生成與菌體濃度呈正相關。在發酵20 h時菌體濃度與酶活力達到最高，其中酶活力達到(4 496.60±141.22)U/L。圖7-a為分批發酵時的破碎上清液的蛋白電泳圖，將菌體濃度稀釋到同一水平進行細胞破碎。上樣量一致情況下，可以明顯看出隨著誘導時間的增加，單位菌體的目的蛋白含量明顯增加。達到一定閾值后，總的目的蛋白含量隨著菌體濃度增加持續增加。

在分批發酵的過程中，發酵到14 h溶氧開始反彈，這可能是碳源缺乏造成。通過恒速流加一定量的甘油為發酵過程提供充足的碳源，如圖6-b所示，發酵到46 h的酶活力最高可達到(9 682.62±191.16)U/L。圖7-b為流加甘油發酵時細胞破碎上清液的蛋白電泳圖，與未流加甘油時進行同樣的處理，可以看出隨著發酵的進行，單位菌體的目的蛋白含量在增加，并且達到一定的閾值，菌體濃度提升的過程中，總蛋白產量也在增加。

a-恒定pH；b-恒定溶氧圖6 發酵罐中控制恒定pH與溶氧對發酵的影響Fig.6 Influence of constant pH and dissolved oxygen on fermentation in fermentation tank

a-分批發酵時的破碎上清液；b-流加甘油發酵時細胞破碎上清液圖7 發酵罐的蛋白電泳圖Fig.7 Protein electrophoresis of fermentation tank

3 結論

在微生物發酵過程中，培養基的成分與工藝對于發酵生產水平有著重要的影響。本研究首先在搖瓶的水平上對培養基的碳源、氮源、無機鹽與金屬離子進行了單因素優化，再通過PB實驗與Box-Behnken實驗對其中的顯著因素進行響應面優化實驗，獲得最佳的培養基優化方案。結果表明最佳的培養基配方為甘油10 g/L，酵母粉23 g/L，蛋白胨14 g/L，MgSO4·7H2O 1.3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，優化后培養基的酶活力是基礎培養基的1.94倍。優化的最佳發酵條件為OD600達到1.8時添加誘導劑，接種量5%，誘導溫度20 ℃，誘導時間22 h，IPTG濃度0.4 mmol/L，裝液量40 mL/250 mL。經過發酵條件的優化，酶活力再次提高了3.03倍。

用5 L發酵罐對搖瓶的工藝進行放大時，由于可以維持恒定的pH與溶氧，菌體濃度與酶活力有了進一步的提升。當發酵到14 h時，由于碳源的缺乏，溶氧出現了反彈現象。恒速流加甘油后，溶氧一直維持在30%，菌體濃度與酶活力較分批發酵均提高了1倍以上，最終的酶活力為搖瓶的2.7倍。通過一系列的條件優化，鹵代烷脫鹵酶的發酵生產水平有了顯著提高。目前在發酵罐進行的只是初步放大驗證，后續可以在發酵罐上對工藝進行優化與放大，對補料策略、誘導策略等進行探索以獲得更高的產量，為實現鹵代烷烴脫鹵酶(DhaA)的工業化生產奠定基礎。