一種新型檢測大腸桿菌O157∶H7的免疫磁珠-量子點納米顆粒的制備和應用

文湘郡，滕鑫，丁星宇，佘竹欣，李壹，熊曉輝

(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211800)

食品安全在全世界引起了越來越多的關注[1]。食源性疾病大多由食用了被15種致病菌污染的食物引起的[2]。其中，EscherichiacoliO157∶H7是一種主要的食源性致病菌，常導致溶血性尿毒癥綜合征、血性腹瀉等嚴重疾病，甚至導致死亡[3]，特別是在不發達國家和地區[4]。感染極低劑量的活E.coliO157∶H7即可引起疾病并進一步引發疫情[5-7]，對其快速、靈敏的檢測方法有助于臨床管理和預防傳播。

現已發展了多種檢測E.coliO157∶H7的方法，經典標準檢測方法是瓊脂平板培養法[8-9]，該法簡單可靠，但耗時長，可能延誤患者治療的時機和疫情的控制[10]。聚合酶鏈式反應因時間短、靈敏度高而被國家食品安全標準推薦，但往往需要訓練有素的技術人員和復雜的DNA提取程序[11]。酶聯免疫吸附試驗具有快速檢測和高通量的特點，但缺乏足夠的靈敏度，檢測限為104CFU/mL[11-12]。電化學發光和表面等離子體共振也被用于病原體檢測[13-14]。YU等[15]提出了一種檢測E.coliO157∶H7的石英晶體微天平傳感器，在50 min內可檢測到低至1.46×103CFU/mL的E.coliO157∶H7，靈敏度高，但整個過程步驟繁多。上述方法均難以滿足E.coliO157∶H7現場檢測的要求。因此，開發一種簡單、靈敏、快速的細菌檢測方法對保證食品安全有著至關重要的作用。

量子點又稱納米晶體，是粒子尺寸小于或接近激子玻爾半徑的納米晶體粒子，在被激發時能產生熒光發射。它們通常由第II-VI組、第III-V組或第IV-VI組元素組成。量子點具有斯托克斯位移大、激發光譜寬、發射光譜窄、光學穩定性好、量子產率高、發射波長可調等獨特的光學特性[16-17]，在食源性致病菌檢測中具有很大的應用潛力[18]。免疫磁分離技術具有簡單、快速、特異性強的優點[19]。

本研究建立了一種基于免疫磁珠富集和量子點發光的便捷、靈敏檢測樣品中E.coliO157∶H7的熒光免疫分析法。首先使用SiO2、羧基和E.coliO157∶H7抗體依次包覆Fe3O4納米顆粒制得的免疫磁珠對樣品中的E.coliO157∶H7進行富集，然后使用由量子點標記過的抗體，即熒光探針與E.coliO157∶H7結合，磁分離后，使用熒光光譜儀測定其發光強度，從而得到樣品中E.coliO157∶H7的濃度。將SiO2包覆在磁珠表面，可以減少其非特異性吸附，從而提高對目標菌的選擇性并且有效的阻止了三明治結構中量子點因電子轉移至Fe3O4而引起的熒光猝滅，為分析方法的可行性提供了保證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Pure掃描電子顯微鏡，荷蘭Phenom公司；透射電子顯微鏡，荷蘭Philips公司；Nicolet IS5傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司；熒光光譜光度計，日本Hitachi High-Tech公司。

乙酸鈉、乙二醇、FeCl3·6H2O(生化試劑)，上海生工有限公司；聚乙二醇2000(氣相色譜)、正硅酸乙酯(分析純)、異丙醇、油酸(分析純)，麥克林有限公司；二乙二醇(氣相色譜)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC]，阿拉丁有限公司；氨水(分析純)、無水乙醇(>99.5%)，西隴科學股份有限公司；N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)，美國Aldrich公司；LB肉湯(生物試劑)，海博生物計數有限公司；量子點，蘇州星爍納米科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7 CICC 21530，廣東省微生物菌種保藏中心；大腸桿菌O157∶H7抗體，武漢華美生物工程有限公司。

1.2 E.coli O157∶H7的培養

將細菌培養物儲存在-20 ℃的甘油中，然后在LB肉湯中37 ℃過夜培養進行激活。取上述菌液100 μL加入到40 mL LB肉湯培養基中，37 ℃，160 r/min，搖勻2.5 h，去除培養基后，用無菌PBS連續10倍稀釋使最終濃度為1.0×101～1.0×108CFU/mL。將100 μL的稀釋液涂布于LB瓊脂平板表面上，37 ℃培養22～24 h，計數可見菌落。

1.3 免疫磁珠Fe3O4@SiO2@Ab1的制備

以FeCl3·6H2O為鐵源，無水乙酸鈉為沉淀劑，聚乙二醇2000為表面活性劑，在還原劑乙二醇和二乙二醇的混合溶液中，200 ℃反應12 h，制備了單分散性良好、粒徑均一的Fe3O4納米粒子。

將1.0 g粒徑200 nm的Fe3O4分散在20 mL去離子水中，分散均勻后加入4 mL氨水(質量分數為32%)和120 mL異丙醇溶液。超聲混勻25 min后，用分液漏斗將20 mL異丙醇和4 mL正硅酸乙酯的混合溶液逐滴加入到混合物中，調整水浴鍋溫度為35 ℃，氮氣保護下連續攪拌20 h。待結束反應后，磁分離回收Fe3O4@SiO2，經過多次去離子水和乙醇洗滌后，真空干燥，儲存備用[20]。

將100 mg的Fe3O4@SiO2分散在4 mL去離子水中，分散均勻后加入12 mL氨水和4 mL油酸。70 ℃反應1 h，使用無水乙醇清洗3次后，磁分離回收，隨后加入30 mL 0.02 mol/L的KMnO4，快速機械攪拌8 h，磁分離，經過多次去離子水和乙醇洗滌后，真空干燥，儲存備用[21]。

隨后使用EDC和NHS對Fe3O4@SiO2上的羧基進行活化，加入E.coliO157∶H7的抗體，37 ℃空氣浴振蕩5 h制得免疫磁珠Fe3O4@SiO2@Ab1，合成路線如圖1-a所示。

a-Fe3O4@SiO2@Ab1；b-Qds@Ab2圖1 Fe3O4@SiO2@Ab1和Qds@Ab2的合成路徑圖Fig.1 Synthetic route of Fe3O4@SiO2@Ab1 and Qds@Ab2

使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察免疫磁珠形貌；采用溴化鉀顆粒技術，在傅里葉光譜儀上獲得免疫磁珠表面官能團性質；采用SEM對樣品在10 kV加速電壓下的形貌進行了表征；利用透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)獲得了納米粒子的尺寸和結構細節，將納米粒子懸浮液滴在碳涂層銅網格上，制得透射電鏡樣品。

1.4 熒光探針Qds@Ab2的制備

將量子點與E.coliO157∶H7的抗體置于室溫下空氣浴振蕩30 min得到熒光探針Qds@Ab2，合成路線圖如圖1-b所示。

1.5 E.coli O157∶H7免疫捕獲條件的優化

應用Miscellaneous設計和響應面方法，研究在105CFU/mL的菌液濃度中免疫磁珠添加量、熒光探針添加量、孵育時間和磁分離時間4個自變量對E.coliO157∶H7的影響，因素和水平如表1所示。使用Design-Expert V8.0.6.1軟件設計方案，建立回歸模型，通過計算得到應用于實際樣品時滿足檢測要求的最優組合。

表1 免疫磁分離體系檢測E.coli O157∶H7熒光強度的試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for fluorescence intensity of E.coli O157∶H7 by immunomagnetic separation system

1.6 E.coli O157∶H7的檢測

在優化條件下，在離心管中分別加入40 μL免疫磁珠、100 μL菌液，37 ℃下孵育45 min，磁分離，使用PBS清洗3次后定容到100 μL；隨后添加20 μL抗體-量子點復合物，室溫下搖床反應30 min，反應完畢后，磁分離，并用100 μL PBS定容。如圖2所示，游離的E.coliO157∶H7首先與免疫磁珠結合，然后由量子點標記的抗體與E.coliO157∶H7結合，形成一個三明治結構最后將“免疫納米磁珠-菌-免疫量子點”復合物進行熒光檢測。

圖2 反應原理圖Fig.2 Overall working principle of the approach

選擇與E.coliO157∶H7相近的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌等食源性致病菌對模型的特異性進行檢測。

在1 g牛肉樣品中加入1 mL一定濃度的菌液，等其自然風干后，在其中加入2 mL體積分數為3%三氯乙酸、7 mL PBS，渦旋后8 000 r/min離心10 min；取1 mL含有一定濃度菌液的牛奶、蜂蜜，在其中加入2 mL體積分數為3%三氯乙酸、7 mL PBS，混合均勻后在5 000 r/min離心10 min。將沉淀棄去，分別在上清液中加入1 mol/L NaOH調節pH至7.0，定容后用pH為7.4的PBS稀釋上清液5～10倍，制備菌液終濃度為0～108CFU/mL的加標牛肉、牛奶、蜂蜜樣品。最后根據上述所提出的免疫磁分離體系對添加的樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 免疫磁珠的表征

2.1.1 紅外光譜表征

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@Ab1的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrogram of Fe3O4 particles, Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2@Ab1

2.1.2 SEM表征

如圖4所示，對比Fe3O4和Fe3O4@SiO2的SEM圖像，Fe3O4尺寸較小，表面粗糙(圖4-a)。從圖4-b可知，SiO2包覆Fe3O4后，顆粒團聚減少，表面光滑。結果表明，SiO2幾乎均勻的分布在Fe3O4表面上。

a-Fe3O4；b-Fe3O4@SiO2圖4 Fe3O4和 Fe3O4@SiO2的SEM表征圖Fig.4 SEM graphs of Fe3O4 and Fe3O4@SiO2

2.1.3 TEM表征

如圖5所示，Fe3O4納米顆粒由許多納米晶簇形成[24]，形狀為球形，表面粗糙，粒徑約為200 nm，分散性均一性較好(圖5-a)。SiO2包覆在Fe3O4顆粒表面之后，Fe3O4@SiO2的粒徑增加至576 nm，SiO2的殼層厚度在376 nm左右(圖5-b)，與Fe3O4納米粒子相比，Fe3O4@SiO2表面變為光滑的球形結構，可有效防止Fe3O4在空氣中氧化。其次，SiO2層的引入增加了材料的生物相容性[25]，同時也可以阻斷Fe3O4上的電子轉移，減少由于電子轉移造成的量子點熒光猝滅。

a-Fe3O4；b-Fe3O4@SiO2圖5 Fe3O4和Fe3O4@SiO2的TEM表征圖Fig.5 TEM images Fe3O4, Fe3O4@SiO2

2.2 E.coli O157∶H7免疫捕獲條件的優化

按照1.6節的實驗方法，依照實驗因素水平表1進行27次試驗，以回收率為指標，各因素組合下E.coliO157∶H7回收率的結果如表2所示。

表2 E.coli O157∶H7試驗設計方案與結果Table 2 Miscellaneous test design scheme and results of E.coli O157∶H7

(1)回歸方程及方差分析

以回收率為響應值，各因素之間的關系建立的二次回歸方程如下:

Y=102.06+21.19A+19.32B+1.27C+0.98D+9.09AB-2.75AC-5.45AD-3.15BC+2.77BD-3.28CD-29.58A2- 27.99B2-9.42C2-1.24D2

式中：Y，回收率；A，免疫磁珠添加量；B，熒光探針添加量；C，孵育時間；D，磁分離時間。

方差分析(表3)表明得到的回歸方程極顯著，模型的F值為8.06，模型P<0.05，表明模型具有統計學意義。Y的相關系數R2=0.903 8，表明實測值與預測值吻合較好。擬合損失值為0.373 2，>0.05，不存在擬合損失因子。因此，該模型可用于分析各種因素對免疫磁分離體系檢測細菌的影響，優化和預測滿足檢測條件的最佳條件。

表3 響應面實驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

注:*，對結果影響顯著(P<0.05)；**，對結果極顯著影響(P<0.01)

(2)各因素交互作用分析

回歸方程模擬了4個因素對免疫磁分離體系檢測E.coliO157∶H7回收率的影響，如圖6所示，通過三維響應面圖的分析，可以更直觀地發現不同變量對免疫磁分離體系檢測到的回收率的影響，表面高度越高、顏色越深，回收率越好。故免疫磁分離體系的最優條件為免疫磁珠添加量40 mg、熒光探針添加量20 μL、孵育時間45 min、磁分離時間1.5 min。

圖6 免疫磁分離體系檢測細菌響應面圖Fig.6 Response surface diagram of bacteria detected by immunomagnetic separation system

(3)實驗驗證

為使E.coliO157∶H7的回收率在80%～120%，目標值接近100%，利用本模型得出免疫磁珠最佳添加量為40 mg、熒光探針最佳添加量為20 μL。為了驗證本模型預測值的準確性，進行回歸模型的驗證實驗，進行3次平行實驗，取平均值。實際測得E.coliO157∶H7的回收率為97%，與預測結果接近，說明優化結果可信，有實際指導作用。

2.3 E.coli O157∶H7的檢測

細菌樣品中472 nm處的熒光強度(fluorescence intensity，FI)與E.coli細胞數(N)的關系如圖7所示。

a-不同菌液濃度的熒光強度；b-標準曲線圖7 E.coli O157∶H7在472 nm處的熒光檢測Fig.7 The intensities of fluorescence peaks at 472 nm as functions of the concentrations of E.coli O157∶H7

細胞數在10～108CFU/mL范圍內時，E.coliO157∶H7的回歸模型為：FI=34.32e(lgN/2.03)+24.20e(lgN/4.11)-1.81，R2=0.989 45。這些結果表明，通過測量472 nm處的熒光強度可以確定E.coliO157∶H7的細菌數量，檢測可在2 h內完成且檢測范圍為10～108CFU/mL，檢出限為10 CFU/mL。

將免疫磁珠分別加入104CFU/mL的E.coliO157∶H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌中，在優化條件下根據1.6所提出的模型對添加的樣品進行檢測。回收率如圖8所示，該免疫磁分離體系對E.coliO157∶H7有很好的選擇性。

圖8 免疫磁分離體系對E.coli O157∶H7的特異性Fig.8 Specificity of immunomagnetic separation system for E.coli O157∶H7

實際樣品中，該免疫磁分離體系對E.coliO157∶H7的回收率見表4，分別為80%～120%，相對標準差(relative standard deviation，RSD)值均不高于7.8%。

表4 Fe3O4@SiO2@Ab1對食品樣品中添加的E.coli O157∶H7的回收率Table 4 Recovery efficiency of E.coli O157∶H7 spiked in food samples by the Fe3O4@SiO2@Ab1

3 結論

本文建立了免疫磁珠和熒光量子點標記的抗體檢測E.coliO157∶H7的方法。采用溶劑熱法制備了Fe3O4納米顆粒，并用SiO2、羧基和E.coliO157∶H7抗體依次包覆制得免疫磁珠。游離的E.coliO157∶H7首先與免疫磁珠結合，然后由量子點標記的抗體與E.coliO157∶H7結合，形成一個三明治結構；隨后分析磁分離采集的磁珠的熒光強度(激發/發射波長為370 nm/472 nm)。在引入SiO2殼層后，能減少傳統免疫磁珠的非特異性吸附，從而提高對目標菌的選擇性，SiO2的殼結構能有效地阻止量子點因電子轉移至Fe3O4而引起的熒光猝滅。動態范圍為10～108CFU/mL，檢出限為10 CFU/mL。牛肉、牛奶和蜂蜜樣品中E.coliO157∶H7的平均加樣回收率分別為95%～104%、90%～94%、90%～110%；RSD分別為2.1%～3.8%、3.2%～7.8%、5.8%～6.3%。該方法縮短了傳統方法的檢測時間，提高了檢測效率。