低含水量條件下大曲中抑制土味素的功能微生物解析

張溪桐，徐巖，杜海*

1(江南大學(xué)，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

土味素污染廣泛存在，對(duì)水產(chǎn)品[1]、果汁[2]、葡萄酒[3]等食品和飲料的安全與風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生影響，且在天然發(fā)酵食品中尤為突出。土味素是鏈霉菌、藍(lán)細(xì)菌和某些真菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[4-5]，會(huì)導(dǎo)致泥土氣味[6]。土味素具有極低的感官閾值(6～10 ng/L)，通常在45 ℃，質(zhì)量濃度為7 ng/L時(shí)人們開(kāi)始感到不適[7-8]。泥土異味可能會(huì)對(duì)健康造成一定程度的影響，例如頭痛或胃部不適[9]。

中國(guó)白酒發(fā)酵是典型的多菌種固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，采用了邊糖化邊發(fā)酵的方式，由谷物為原料，大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過(guò)蒸煮、糖化發(fā)酵、蒸餾、儲(chǔ)存、勾兌等獨(dú)特工藝制成[10]，獨(dú)特的釀造工藝賦予了白酒復(fù)雜的香氣成分[11]。作為糖化發(fā)酵劑，大曲在白酒釀造中發(fā)揮著重要的作用，為白酒發(fā)酵過(guò)程貢獻(xiàn)了許多發(fā)酵功能性微生物[11]。大曲在開(kāi)放的環(huán)境中通過(guò)自發(fā)固態(tài)發(fā)酵工藝制造而成，自然接種的霉菌、細(xì)菌和酵母菌在大曲中形成了獨(dú)特的微生物菌群，并通過(guò)生長(zhǎng)和代謝提供各種酶和風(fēng)味化合物[12-13]。因此，大曲中的微生物在很大程度上決定了大曲和原酒的典型特征。然而，在開(kāi)放系統(tǒng)中，環(huán)境中存在的一些微生物可能會(huì)在大曲發(fā)酵過(guò)程中造成污染[14]。

近年來(lái)，土味素污染對(duì)白酒風(fēng)味品質(zhì)的負(fù)面影響越來(lái)越受到關(guān)注。高濃度的土味素會(huì)給白酒帶來(lái)發(fā)霉異味。DU等[5]在制曲過(guò)程中檢測(cè)到了較高的土味素含量(約為6 μg/kg)。經(jīng)可培養(yǎng)驗(yàn)證證明大曲中鏈霉菌是白酒中土味素的主要生物源頭。鏈霉菌可以產(chǎn)生大量抗生素，這些抗生素會(huì)抑制釀造功能性酵母和霉菌的生長(zhǎng)和代謝，并減少其貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)[14-15]。在各種香型白酒中，清香型白酒受到了最顯著的負(fù)面影響。因此，在制曲過(guò)程中探索一種抑制土味素生成的方案是必要的。

生物防治作為一種有效的、環(huán)境友好的方法，已被廣泛用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域[16-17]。生物防治基于微生物群落之間的相互作用，旨在塑造微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝性能，以優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程[18]。通過(guò)接種原位微生物進(jìn)行生物防治是控制發(fā)酵質(zhì)量的有效方法。例如，在葡萄汁中使用非發(fā)酵和低發(fā)酵酵母菌株來(lái)控制曲霉生產(chǎn)赭曲霉毒素A[19]。在本實(shí)驗(yàn)室前期的接種芽孢桿菌模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，顯示出有效降低土味素產(chǎn)生的能力[4]。

本研究采用頂空-固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(head space solid phase microextraction gas chromatography mass spectroscopy，HS-SPME-GC-MS)和高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，測(cè)定了中溫大曲制作過(guò)程中的土味素含量以及微生物群落結(jié)構(gòu)組成。結(jié)合土味素產(chǎn)生時(shí)期和微生物特性，從中溫大曲中篩選出能夠?qū)ν廖端丶版溍咕M(jìn)行生物防治的原位微生物，以期為后續(xù)控制大曲中土味素污染提供支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品收集于陜西省某酒廠，在曲房中靠近門(mén)口、中間及靠近窗戶的3個(gè)位置處各取1塊曲，3塊大曲作為平行跟蹤采集樣本。大曲樣品分別在制曲的前期(發(fā)酵第10天)、后期采集(發(fā)酵第20天)，前期編號(hào)分別為1、2、3，后期編號(hào)分別為4、5、6。將不同培養(yǎng)時(shí)期的大曲曲皮和曲心進(jìn)行分離、粉碎，分別取曲心和曲皮樣品各200 g，采集到的曲皮樣品命名為XP，曲心樣品命名為XX。所有樣品1式3份粉碎后放入密封袋記錄日期和編號(hào)，保存于-80 ℃用于HS-SPME-GC-MS測(cè)定與DNA提取。

1.2 主要試劑與儀器

NaCl、乙醇、異戊醇、三氯甲烷、D(+)-無(wú)水葡萄糖、瓊脂，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司；(+/-)土味素標(biāo)準(zhǔn)品，AccuStandard公司；L-薄荷醇(高級(jí)純)，Sigma-Aldrich公司(中國(guó)上海)；酵母提取物、蛋白胨，Oxoid公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基，URCHEM公司。

Avanti J-E冷凍離心機(jī)，Beckman Coulter公司；NanoDrop 8000蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific公司；PCR儀、凝膠成像儀，Bio-Rad公司；超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超純水系列，美國(guó)Millipore公司；Mini-Beadbeater細(xì)胞破碎儀，Biospec公司。

1.3 微生物的分離與培養(yǎng)條件

用于生物防治試驗(yàn)的鏈霉菌為白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)FXJ，該菌株從中溫大曲中分離，鑒定并保存于本實(shí)驗(yàn)室。在鏈霉菌菌株分離鑒定的過(guò)程中白色鏈霉菌出現(xiàn)的頻率和含量最高，且在中溫大曲中很常見(jiàn)，在不同酒廠的中溫大曲中都有該菌株存在，具有代表性。該菌株產(chǎn)土味素的能力強(qiáng)(30 ℃液態(tài)發(fā)酵7 d后可產(chǎn)生143.53 μg/L土味素)，且預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該鏈霉菌的生長(zhǎng)速度快于其他分離出的鏈霉菌菌株，所以從提高實(shí)驗(yàn)效率的角度，本研究選擇了S.albusFXJ作為模式菌株。鏈霉菌使用PDA培養(yǎng)基30 ℃活化48 h。試驗(yàn)菌株為從中溫大曲中分離出的大曲培養(yǎng)所必需的霉菌。為了篩選出大曲中對(duì)鏈霉菌有抑制作用的微生物，將5 g樣品與45 mL無(wú)菌NaCl溶液(0.85 g/L) 充分?jǐn)嚢杌旌?0 min，制備10倍梯度稀釋溶液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6)，將稀釋的溶液分別涂布在YPD培養(yǎng)基(g/L)(蛋白胨20，葡萄糖20，酵母提取物10，瓊脂20)上，30 ℃培養(yǎng)。參照DU等[20]篩選微生物的方法，在霉菌分離實(shí)驗(yàn)中，加入0.12 mg/L的氨芐青霉素抑制細(xì)菌。基于微生物的特征，挑出每個(gè)平板中的單菌落，劃線純化并保藏于甘油管中。

1.4 從大曲中分離篩選鑒定對(duì)S.albus有抑制作用的微生物

通過(guò)改良的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定分離株對(duì)S.albus的拮抗作用。在已覆蓋有50 μLS.albusFXJ(每毫升含有107孢子)菌苔的PDA平板中間放置直徑為4 mm的無(wú)菌濾紙片，將10 μL分離物的培養(yǎng)液加入濾紙片中，30 ℃培養(yǎng)5 d。生長(zhǎng)抑制情況可以被量化為抑菌圈直徑大小。

1.5 核酸提取、測(cè)序及生物信息學(xué)分析

大曲樣品的前處理與DNA提取參考SONG等[21]的方法，NanoDrop儀器用來(lái)檢測(cè)基因組中總DNA濃度，檢測(cè)后保存于-20 ℃冰箱中。細(xì)菌使用通用引物組F338和R806擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2區(qū)域用引物ITS3和ITS4擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并通過(guò)Thermo Scientific NanoDrop 8000評(píng)估濃度。使用BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)將獲得的基因序列與NCBI中的可用序列進(jìn)行比較。使用位于中國(guó)北京AuwiGene Technology的Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina，San Diego，CA，美國(guó))對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。生物信息學(xué)分析方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.6 大曲含水量測(cè)定

取10 g大曲樣品，在105 ℃的烘箱中放入待測(cè)的大曲樣品，烘干4 h，于干燥皿中冷卻30 min，再次烘干1 h至恒重。稱量樣品質(zhì)量，含水量的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.7 大曲分離株耐低含水量能力測(cè)定

利用在本地獲取的小麥作為模擬固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)，粉碎后80 ℃下烘12 h至絕干，高壓滅菌后用作初始固態(tài)基質(zhì)。在含有5 g固態(tài)基質(zhì)的50 mL離心管中對(duì)大曲分離株進(jìn)行耐低含水量實(shí)驗(yàn)。將孢子懸浮液接種到每個(gè)燒瓶中，初始濃度為106/g(每克小麥中含有的孢子數(shù)，下同)，調(diào)整固態(tài)發(fā)酵體系中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、5%、10%、15%、20%。將燒瓶30 ℃培養(yǎng)7 d，微生物的生長(zhǎng)情況被量化為培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)孢子情況。培養(yǎng)結(jié)束后取出每個(gè)樣品5 g，用鋁箔包裹，液氮冷凍后-80 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.8 大曲分離株對(duì)土味素的抑制情況測(cè)定

進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以研究大曲中分離出的微生物菌株對(duì)土味素產(chǎn)生的抑制情況。固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)制作方法同1.7，S.albusFXJ在含有100 g固態(tài)基質(zhì)的250 mL燒瓶中與大曲分離株進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將鏈霉菌孢子懸浮液接種到燒瓶中，初始濃度為106/g，然后接種洗滌過(guò)的霉菌孢子，控制初始濃度分別為103、104、105、106/g，調(diào)整固態(tài)發(fā)酵體系中含水量為20%。以S.albusFXJ單培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生土味素情況作為對(duì)照。將燒瓶30 ℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后取出每個(gè)樣品5 g，用鋁箔包裹，液氮冷凍后-80 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.9 大曲中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.9.1 大曲樣品前處理

稱取5 g粉碎后的大曲樣品于50 mL旋蓋離心管中，加入20 mL超純水，渦旋振蕩5 min，冰浴超聲30 min，于4 ℃靜置過(guò)夜，然后9 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.9.2 GC-MS風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

取大曲浸提液5 mL加入20 mL頂空瓶中，加入1.5 g NaCl飽和，加入10 μL，質(zhì)量濃度為4 mg/L的薄荷醇作為內(nèi)標(biāo)，使用HS-SPME-GC-MS的方法檢測(cè)大曲中的土味素及其他風(fēng)味物質(zhì)含量。HS-SPME參數(shù)與GC-MS分析參考DU等[15]的方法。

1.9.3 土味素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將一定量的土味素加入10%乙醇水溶液中，土味素的質(zhì)量濃度為0.1～20 μg/L。通過(guò)計(jì)算土味素(m/z112)與薄荷醇(m/z95)的峰面積比與濃度比得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9.4 土味素抑制率計(jì)算

從大曲中篩選出的霉菌對(duì)土味素產(chǎn)生的抑制率按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：ρ1，樣品中土味素質(zhì)量濃度；ρ2，對(duì)照組中土味素質(zhì)量濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖

使用Excel 2016、Origin Pro 2021和Adobe Illustrator CC 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)繪圖，顯著性水平設(shè)定在0.05。主成分分析(principal component analysis，PCA)通過(guò)CANOCO5進(jìn)行。Spearman等級(jí)相關(guān)性的計(jì)算通過(guò)R中的vegan包進(jìn)行(http://vegan.r-forge.r-project.org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同制曲時(shí)期土味素的含量與含水量

大曲中的土味素含量與含水量變化情況如圖1所示。土味素的變化情況與含水量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，土味素含量雖然有波動(dòng)但是整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而大曲的含水量則隨著發(fā)酵進(jìn)行而降低。在大曲入房時(shí)含水量為(34.73±0.57)%，出房時(shí)期含水量則為(12.05±0.55)%。制曲過(guò)程中，曲皮中的土味素含量在0～10 d迅速升高，在第10天達(dá)到(7.29±0.39) μg/kg，在第15天出現(xiàn)一個(gè)小波動(dòng)后，隨后在20 d達(dá)到最高含量(9.75±0.50) μg/kg。曲心中土味素含量在0～5 d同樣快速增長(zhǎng)，但隨后的波動(dòng)較平穩(wěn)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，含水量的差異是導(dǎo)致曲皮、曲心微生物差異的重要因素。發(fā)現(xiàn)由于曲皮與空氣接觸面積更大，導(dǎo)致曲皮中的含水量低于曲心[22]。

圖1 大曲中土味素含量與含水量的關(guān)系Fig.1 Relationship between geosmin and water content in Daqu

圖1顯示曲皮中的土味素存在2個(gè)快速產(chǎn)生階段，0～10 d和15～20 d。0～10 d土味素的產(chǎn)生速率為0.729 μg/(kg·d)，15～20 d則為0.742 μg/(kg·d)。土味素在制曲后期的產(chǎn)生速率高于制曲前期的產(chǎn)生速率。在固態(tài)發(fā)酵體系中，產(chǎn)土味素的鏈霉菌與大曲中的功能微生物存在一定程度的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在同一體系中，酵母、霉菌等功能微生物的快速生長(zhǎng)會(huì)對(duì)鏈霉菌存在一定程度的抑制作用[23]。結(jié)合制曲過(guò)程中含水量的變化，研究推測(cè)可能是酵母等功能微生物在低含水量的條件下生長(zhǎng)緩慢，無(wú)法與鏈霉菌形成足夠的競(jìng)爭(zhēng)，所以在制曲后期含水量下降后，曲皮中的土味素含量出現(xiàn)了第2個(gè)快速增長(zhǎng)期。因此需要找到在低含水量下可快速生長(zhǎng)的微生物，重新與鏈霉菌形成競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制土味素的產(chǎn)生。

2.2 大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 不同區(qū)域、不同時(shí)期的微生物多樣性差異

本研究通過(guò)豐富度指數(shù)(Chao1)和多樣性指數(shù)(Shannon)來(lái)評(píng)價(jià)大曲中的微生物α多樣性。如圖2所示，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)均高于真菌群落。圖2-a顯示曲皮和曲心在微生物豐富度上無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在多樣性方面，無(wú)論是細(xì)菌或真菌，曲心的豐富度均稍高于曲皮，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在時(shí)間差異上(圖2-c，圖2-d)，細(xì)菌群落在制曲后期的豐富度和多樣性均高于前期，而真菌群落在制曲后期的豐富度和多樣性稍有降低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而真菌豐富度和多樣性的降低可能是導(dǎo)致制曲后期土味素含量升高的原因。

a-曲心和曲皮 Chao1指數(shù)；b-曲心和曲皮 Shannon指數(shù); c-制曲前期和后期 Chao1指數(shù)；d-制曲前期和后期 Shannon指數(shù)圖2 大曲中微生物群落的α多樣性Fig.2 α Diversity of microbial communities in Daqu

2.2.2 細(xì)菌屬水平分析

高通量測(cè)序顯示大曲樣品中在細(xì)菌屬水平共檢測(cè)到個(gè)117屬。其中，大曲曲皮中檢測(cè)到91個(gè)屬，曲心中檢測(cè)到了112個(gè)屬。本研究將大曲中相對(duì)豐度最高的19個(gè)細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢(shì)種屬，得到其水平信息如圖3-a所示。鏈霉菌屬作為主要的土味素生產(chǎn)者，通常被認(rèn)為是大曲制作過(guò)程中嚴(yán)重的微生物污染[4-5]。鏈霉菌屬在曲皮中的相對(duì)豐度(3.11%)顯著高于曲心(0.22%)，在制曲后期鏈霉菌屬(2.08%)的相對(duì)豐度高于制曲前期(1.00%)。與圖1土味素含量結(jié)論相符。

為了更直觀地說(shuō)明大曲中細(xì)菌群落的差異，本研究通過(guò)基于weighted UniFrac距離的PCA對(duì)細(xì)菌群落的β多樣性進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖3-b)。大曲的發(fā)酵過(guò)程是在開(kāi)放式的環(huán)境中自發(fā)的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵最大的差異是其不均一性，所以重復(fù)之間的微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)存在一定的差異。PCA結(jié)果顯示大曲中細(xì)菌群落的差異主要由曲心和曲皮的差異造成，不同重復(fù)之間存在差異但是不同組別之間的差異更大。

a-大曲屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分布；b-基于weighted UniFrac距離的PCA圖3 大曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community compositions of Daqu samples

2.2.3 真菌屬水平分析

高通量測(cè)序顯示大曲樣品中在真菌屬水平共檢測(cè)到34個(gè)屬，其中大曲曲皮中檢測(cè)到30個(gè)屬，大曲曲心中檢測(cè)到了33個(gè)屬。本研究將大曲中相對(duì)豐度最高的19個(gè)真菌屬定義為優(yōu)勢(shì)種屬，得到其水平信息如圖4-a所示。在曲皮中，畢赤酵母屬(Pichia)是有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的真菌屬，有最高的相對(duì)豐度，(78.49±8.65)%；在曲心中，嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)則取代了曲皮中畢赤酵母屬的優(yōu)勢(shì)，豐度為(58.35±6.48)%，成為了曲心中最具有優(yōu)勢(shì)的真菌屬。

a-大曲屬水平優(yōu)勢(shì)真菌分布；b-基于weighted UniFrac距離的PCA圖4 大曲樣品真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal community compositions of Daqu samples

由圖1和2.2.2分析可知，曲皮和制曲后期都存在較高的土味素含量和鏈霉菌含量。Thermoascus、Aspergillus和Trichosporon在曲皮中的相對(duì)豐度比曲心中要低。同時(shí)，Pichia、Saccharomycopsis、Rhizopus、Candida和Trichosporon在制曲后期的相對(duì)豐度低于制曲前期。有研究表明，畢赤酵母屬是白酒釀造過(guò)程中的主要功能性真菌，對(duì)大曲和白酒的風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)[24]。嗜熱子囊菌屬、曲霉屬和根霉屬可以分泌大量的胞外酶，參與淀粉和復(fù)合聚合物的分解同時(shí)，為發(fā)酵過(guò)程提供可用于發(fā)酵的糖類，同時(shí)真菌的群落結(jié)構(gòu)功能等對(duì)大曲的品質(zhì)有很重要的影響[18,25]。以上結(jié)果均為后續(xù)篩選抑制鏈霉菌與土味素的微生物提供思路。

PCA結(jié)果進(jìn)一步表明大曲中微生物群落分布規(guī)律(圖4-b)。大曲中真菌群落的差異主要由曲心和曲皮的差異造成，制曲階段對(duì)大曲的真菌群落造成的影響較小。

2.2.4 微生物屬水平相關(guān)性分析

為了探究大曲發(fā)酵過(guò)程中與土味素與鏈霉菌呈負(fù)相關(guān)的微生物，基于Spearman等級(jí)相關(guān)性(|P|>0.2和P<0.05)探索了中溫大曲中微生物與土味素之間的關(guān)系(圖5)。幾種微生物與土味素和鏈霉菌均呈負(fù)相關(guān)性，如魏斯氏菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、橫梗霉屬、根霉屬和毛孢菌屬等。從計(jì)算所得呈負(fù)相關(guān)性的微生物中，進(jìn)一步篩選抑制鏈霉菌的微生物。

圖5 十七個(gè)關(guān)鍵微生物屬與土味素的相關(guān)性關(guān)系Fig.5 Relationship between 17 key microorganisms and geosmin注：熱圖的顏色表示Spearman相關(guān)性(R)的大小，紅色和藍(lán)色分別表示關(guān)鍵微生物與土味素之間的正負(fù)相關(guān)性關(guān)系，GSM表示土味素

2.3 對(duì)產(chǎn)土味素的鏈霉菌有抑制作用的微生物篩選

從源頭控制土味素污染，確定原位微生物對(duì)鏈霉菌的拮抗?jié)摿哂兄匾饬x。在大曲中共分離出37株霉菌。通過(guò)改良的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定所有分離株對(duì)S.albusFXJ的拮抗作用(圖6)。其中，6株表現(xiàn)出明顯的抑制作用。通過(guò)18S rDNA測(cè)序，有抑制效果的6株菌株分別被鑒定為Aspergillussp. LBM32010、Aspergillussp. LBM32013、Rhizopussp. LBM32021、Trichosporonsp. LBM32022、Lichtheimiasp. LBM32026和Trichosporonsp. LBM32030。

a-抑菌圈正面；b-抑菌圈背面圖6 對(duì)鏈霉菌有較明顯抑制作用菌株篩選Fig.6 Selection of strains with obvious inhibitory effect on Streptomyces

大曲中分離出的微生物生長(zhǎng)抑制情況可以被量化為抑菌圈直徑大小。抑菌效果按照抑菌圈直徑分為3種，分別是：3 cm≤D<5 cm、5 cm≤D<7 cm、7 cm≤D。D<3 cm的微生物抑菌效果較差，不予統(tǒng)計(jì)(表1)。

表1 抑菌實(shí)驗(yàn)中效果較好的主要微生物及其在大曲中的相對(duì)豐度Table 1 Main microorganisms with better effect in antibacterial experiment and their relative abundance in Daqu

2.4 大曲來(lái)源的霉菌耐低含水量特性解析

針對(duì)制曲后期含水量下降，鏈霉菌與土味素含量升高的情況，本研究設(shè)計(jì)了10%、15%、20%的含水量質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度，測(cè)試了6株在抑菌實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好的霉菌對(duì)低含水量的耐受情況，霉菌的生長(zhǎng)情況被量化為培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)孢子情況。

所篩選到的6株霉菌均具有在低含水量條件下生長(zhǎng)的能力(圖7)。其中Aspergillussp.LBM32010、Aspergillussp.LBM32013、Trichosporonsp.LBM32030具有更強(qiáng)的耐低含水量的能力。在含水量≥10%時(shí)，Aspergillussp.LBM32010生長(zhǎng)情況最好，2.1小節(jié)顯示，土味素在制曲后期含量最高，含水量在15%～20%，在15%含水量的情況下，Aspergillussp.LBM32010的生長(zhǎng)情況為[(9.72±0.03)lg孢子數(shù)/g]，Aspergillussp.LBM32013的生長(zhǎng)情況為[(9.53±0.05)lg孢子數(shù)/g]，Trichosporonsp.LBM32030的生長(zhǎng)情況為[(9.57±0.08)lg孢子數(shù)/g]。在含水量20%時(shí)，Aspergillussp.LBM32010的生長(zhǎng)情況為[(10.35±0.04)lg孢子數(shù)/g]，Aspergillussp.LBM32013的生長(zhǎng)情況為[(10.02±0.11)lg孢子數(shù)/g]，Trichosporonsp.LBM32030的生長(zhǎng)情況為[(10.08±0.11)lg孢子數(shù)/g]。

圖7 不同含水量條件下霉菌在固態(tài)發(fā)酵體系中的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of fungi in solid-state fermentation system under different water content conditions

在確定了篩選出的微生物菌株可以在含水量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～20%條件下生長(zhǎng)后，實(shí)驗(yàn)繼續(xù)測(cè)試了篩選到的微生物在極端含水量條件下(含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%和5%)的生長(zhǎng)情況，對(duì)耐受能力做極限評(píng)估。在含水量<5%時(shí)，篩選出的微生物仍可以繼續(xù)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)受到了明顯的抑制。

2.5 大曲來(lái)源的霉菌對(duì)土味素的抑制作用

為進(jìn)一步測(cè)試篩選出的微生物對(duì)土味素的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下使用破碎后的小麥模擬了固態(tài)發(fā)酵體系，實(shí)驗(yàn)控制小麥培養(yǎng)基含水量為20%，調(diào)整篩選到的霉菌接種數(shù)量分別為103、104、105、106/g，分別與S.albusFXJ進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分別命名為A～D組，CK為對(duì)照組，為S.albusFXJ單培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。HS-SPME-GC-MS測(cè)定了共培養(yǎng)7 d后固態(tài)發(fā)酵體系中土味素的含量(圖8)，針對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

圖8 大曲來(lái)源的霉菌對(duì)土味素的抑制效果Fig.8 Inhibitory effect of fungi from Daqu on geosmin注：* ,P<0.05;** , P<0.01;*** , P<0.001;N.S.,差異不顯著

鏈霉菌單培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的土味素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(34.79±2.34) μg/kg。隨著篩選出的抑制菌添加量的提高，鏈霉菌生長(zhǎng)代謝受到抑制，土味素的含量明顯下降。雖然5種鏈霉菌抑制微生物在抑制菌∶鏈霉菌=103∶106時(shí)，與鏈霉菌單培養(yǎng)(對(duì)照組)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但土味素含量均有所下降。在5株霉菌與鏈霉菌的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，Aspergillussp.LBM32010對(duì)土味素的抑制效果是最好的，在試驗(yàn)組B、C、D中，土味素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(8.95±3.21) μg/kg，抑制率74.27%(P<0.01)；(4.21±1.13) μg/kg，抑制率87.90%(P<0.001)；(3.11±1.22) μg/kg，抑制率91.06%(P<0.001)。其次是Rhizopussp.LBM32021對(duì)土味素的抑制效果也較好，在試驗(yàn)組BCD中，土味素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(12.90±3.07) μg/kg，抑制率62.92%(P<0.05)；(14.04±6.58) μg/kg，抑制率59.64%(P<0.05)；(8.89±2.79) μg/kg，抑制率74.45%(P<0.01)。在Aspergillussp.LBM32013對(duì)土味素的抑制實(shí)驗(yàn)中，僅在試驗(yàn)組D中對(duì)土味素有顯著性抑制效果，土味素含量為(8.94±3.47) μg/kg，抑制率74.30%(P<0.01)。在Lichtheimiasp.LBM32026對(duì)土味素的抑制實(shí)驗(yàn)中，C、D組均展示了對(duì)土味素顯著的抑制效果，在C組中土味素含量為(12.39±1.57) μg/kg，抑制率64.39%(P<0.05)，在D組中土味素含量為(8.16±5.29) μg/kg，抑制率76.54%(P<0.01)。而在Trichosporonsp.LBM32030的實(shí)驗(yàn)中，土味素含量降低，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 結(jié)果與討論

土味素對(duì)白酒的風(fēng)味與品質(zhì)具有重要影響。本研究從中溫大曲中篩選出6株能夠耐受低含水量，且能夠抑制鏈霉菌生長(zhǎng)和土味素產(chǎn)生的霉菌。其中Aspergillussp.LBM32010和Rhizopussp.LBM32021表現(xiàn)出最強(qiáng)的土味素抑制能力，可以作為控制土味素產(chǎn)生的功能菌株。本研究篩選出的原位功能微生物可在制曲階段作為土味素抑制菌劑添加，在大曲壓制成曲塊前將抑制菌劑與原料混合并壓制成型。研究展現(xiàn)了大曲中原位微生物在低含水量條件下對(duì)鏈霉菌和土味素的抑制能力，突出了生物防治作為一種環(huán)境友好的方法對(duì)痕量揮發(fā)性有機(jī)物防治的潛力，為后續(xù)控制大曲中土味素污染提供支撐，并為精準(zhǔn)調(diào)控微生物群落提供了思路。后續(xù)將會(huì)圍繞該抑制菌劑在實(shí)際生產(chǎn)中的具體應(yīng)用展開(kāi)。進(jìn)一步探究菌種的復(fù)配方案，并評(píng)估抑制菌劑對(duì)大曲的微生物群落、理化性質(zhì)、酶活性和風(fēng)味等方面的影響。