市售茨河花色腐乳和紅方腐乳微生物菌群及風味物質的比較分析

張振東，王玉榮，侯強川，陳富安，郭壯，趙慧君*

1(湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽，441053)2(湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽，441053)3(谷城農韻土特產品開發有限公司，湖北 襄陽，441053)

腐乳，以大豆制成的豆腐為原料，輔以辣椒、食鹽、花椒、紅曲(紅腐乳)等，通過固態發酵制成，其質地細膩，醇香可口，營養豐富，含有豐富的游離氨基酸，尤其是谷氨酸含量較高，還含有B族維生素、礦物質等，易于消化，對人體有益[1-2]。

腐乳按照發酵的微生物類型可以分為細菌型腐乳和毛霉型腐乳，按照顏色可以分為紅方腐乳、青方腐乳、白方腐乳和花色腐乳等[3]。紅方腐乳由于添加了紅曲，因此成品為紅色，而花色腐乳則是除了主要原料豆腐外，還添加了芝麻、玫瑰、蝦仔、香油中的一種或幾種制成。腐乳的制作往往通過開放式的發酵方式，因此不同腐乳的菌群可能存在差異，導致代謝產生的風味物質含量與種類也有不同。目前對于傳統發酵食品的研究多集中在傳統發酵食品的菌群結構及演替、滋味、氣味和揮發性風味物質[4]。

以MiSeq等為代表的第二代測序技術具有通量高、成本低、準確度高，且不依賴于培養條件等特點，能對樣品的低豐度微生物進行檢測與分析，還能與其他組學方法進行聯合分析[5-6]。近年來用于探索菌群結構的擴增子測序的分析方案不斷完善，出現了多種分析平臺，如QIIME，mothur和usearch，以及相應的注釋數據庫如RDP，GreenGene以及SILVA[7-9]，因此該技術被廣泛應用到傳統發酵食品的微生物區系研究。多組學分析方法的發展，不僅能獲得食品的菌群特征，還能結合食品揮發性有機物(volatile organic compound, VOC)進行關聯分析。

紅方腐乳和湖北省谷城市茨河地區的花色腐乳均呈紅色，但是氣味迥異[1]。為分析其菌群與風味的差異，本研究采集了市售的不同廠家的花色和紅方腐乳樣品，進行高通量測序及VOC物質分析，旨在明確并比較花色腐乳與紅方腐乳的微生物菌群特征，總體感官及揮發性風味物質特征，并分析兩種腐乳風味特征與菌群的關聯，以期為后續腐乳品質改良與安全性評價提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Pfu高保真DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、dNTP混合物，寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖，西班牙Biowest公司；E.Z.N.A.?食品DNA提取試劑盒，美國Omega生物科技公司；PCR產物清潔試劑盒，艾思進生物技術(杭州)公司；用于電子舌的內部溶液、參比溶液、陰離子溶液、陽離子溶液和味覺標準溶液，日本Insent公司。

1.2 儀器與設備

Vetiri梯度基因擴增儀，美國AB公司；ND-2000C型微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；SA-402B型電子舌，日本Insent公司；FlavourSpec?氣相色譜-離子遷移譜聯用儀，德國G.A.S公司；DYY-6C型電泳儀，中國北京六一生物科技有限公司；VD-1320-U潔凈工作臺，中國蘇凈安泰公司；LDZX-50KBS蒸汽壓力滅菌器，中國上海申安醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

花色腐乳(n=3，樣品編號為C1-C3)，湖北省襄陽市谷城縣茨河鎮農貿市場3家不同廠家；紅方腐乳(n=4，樣品編號為R1-R4)，上海、浙江紹興、河北張家口和河北衡水不同廠家。樣品運回實驗室后，立刻裝入帶有螺旋蓋子的無菌玻璃樣品瓶，在實驗室迅速用液氮冷凍，隨后放入-70 ℃冰箱備用。

1.3.2 高通量測序

樣品處理過程參照趙恒等[10]的方法進行，使用E.Z.N.A.?食品DNA試劑盒對7份腐乳樣品進行總DNA的提取。然后使用338F和806R獲取腐乳樣品細菌16S rRNA的V3-V4區，另外使用ITS3F和ITS4R擴增樣品真菌ITS間區片段[11]。PCR產物使用Illumina HiSeq測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 生物信息學分析

生物信息學分析參照趙恒等[10]的方法進行，主要使用QIIME v1.9.1平臺[12]。使用cutadapt v1.9(https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)對數據進行過濾，然后按照97%的閾值劃分分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，使用UCHIME去除嵌合體序列[13]，并通過Ribosomal Database Project (RDP) v11.5，GreenGene v13.5和SILVA v132數據庫進行細菌物種注釋[7-9]，使用UNITE v7.2進行真菌物種注釋[14]。樣品的α多樣性與β多樣性及測序深度通過QIIME平臺自帶程序進行計算。

1.3.4 樣品的VOCs分析

對VOCs測定使用FlavourSpec?氣相色譜-離子遷移譜儀(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)：首先準確稱取腐乳樣品1 g，裝入20 mL頂空瓶中，設置進樣針溫度為85 ℃。頂空進樣條件：50 ℃孵育15 min(轉速500 r/min)，自動頂空進樣，進樣量100 μL。GC條件：色譜柱為極性WAX柱(30 m×0.53 mm，1 μm)，柱溫60 ℃，分析時間30 min，載氣N2，載氣流速在0～10 min為2 mL/min，10～20 min升至10 mL/min，20～30 min升至100 mL/min。IMS條件：45 ℃，漂移氣流速150 mL/min。獲取初步數據后，使用NIST數據庫和IMS數據庫可對物質進行定性分析，通過峰面積歸一化法確定各種成分的相對含量。

1.3.5 統計分析

使用SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析，基于t檢驗進行組間差異顯著性檢驗，結果以平均值±標準差表示。主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)、普氏分析和置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，perMANOVA)使用R包vegan v2.5-7(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)；使用R自帶的corr.test函數進行Pearson相關性分析；不同樣品間的生物標志物通過LEfSe(The linear discriminant analysis Effect Size)通過在線服務器(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)進行分析。文中所有圖使用Origin v8.5或者R包ggplot2完成。

2 結果與分析

2.1 腐乳微生物多樣性分析

2.1.1 微生物多樣性

基于MiSeq測序平臺進行腐乳樣品的高通量測序，共獲得了420 944條細菌序列，花色腐乳平均65 664條序列每個樣品，紅方腐乳平均43 258條序列。共聚類得到5 860個OTUs：花色腐乳每個樣品平均1 928個OTUs，紅方腐乳平均1 238個OTUs。當測序深度達到32 010條序列時，稀釋曲線變得平緩，表明測序量足夠反映樣品菌群多樣性。α多樣性分析表明，花色腐乳的Chao1指數與Shannon指數菌低于紅方腐乳，但是僅Chao1指數的差異顯著(P<0.5)，表明花色腐乳的細菌豐富度顯著低于紅方腐乳(圖1)。

a-細菌;b-真菌圖1 花色腐乳和紅方腐乳α多樣性Fig.1 α Diversity of Huase and red sufu

擴增子測序獲得了436 925條真菌高質量擴增子序列，按照97%的閾值，劃分出1 413個OTUs，花色腐乳每個樣品平均309個OTUs，紅方腐乳平均314 OTUs，遠低于細菌的OTU數量。在測序深度達到35 010的基礎上對腐乳真菌α多樣性進行分析，顯示真菌的Chao1指數和Shannon指數均無顯著差異(P>0.05)。

基于UniFrac距離矩陣的PCoA分析表明(圖2)，紅方腐乳與花色腐乳的細菌與真菌菌群在坐標軸上分布在不同的位置；perMANOVA分析進一步證實了紅方腐乳與花色腐乳在細菌與真菌菌群結構上具有顯著差異(P<0.05)。為進一步分析腐乳樣品的菌群特征，計算了腐乳中相對含量大于1%的優勢菌群組成。

a-真菌;b-細菌圖2 基于UniFrac距離的腐乳微生物PCoA圖Fig.2 PCoA plots of microbial community in sufu samples based on UniFrac distance

2.1.2 微生物菌群結構

如圖3-a所示，紅方腐乳的優勢真菌門(相對含量>1%)有：子囊菌門(Ascomycota，57.04%)，擔子菌門(Basidiomycota，39.68%)和毛霉門(Mucoromycota)(1.81%)；而在花色腐乳中，子囊菌門平均相對含量最高(94.24%)，擔子菌門(0.08%)和毛霉門(4.33%)，接合菌門(1.32%)相對含量最低。

a-真菌優勢菌門;b-真菌優勢菌屬;c-細菌優勢菌門;d-細菌優勢菌屬圖3 腐乳樣品優勢微生物類群組成Fig.3 Dominant microbial taxa of sufu samples

在屬水平上(圖3-b)，紅方腐乳共11個優勢真菌屬：紅曲霉屬(Monascus，32.55%)，雙足囊菌屬(Dipodascus，2.13%)，絲孢酵母屬(Trichosporon，20.44%)，紅酵母屬(Rhodotorula，6.12%)，曲霉屬(Aspergillus，2.83%)，Neobulgaria(2.64%)，Chalara(2.16%)，放射毛霉屬(Actinomucor，1.81%)，地霉屬(Geotrichum，1.53%)，節擔菌屬(Wallemia，1.20%)，假絲酵母屬(Candida，1.06%)，僅紅曲霉屬和絲孢酵母屬的相對含量超過了5%；花色腐乳僅有5個優勢真菌屬：威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，46.83%)，雙足囊菌屬(39.44%)，毛霉屬(Mucor，4.30%)，半乳糖酵母屬(Galactomyces，1.68%)，根毛霉屬(Rhizomucor，1.32%)，而其中4個(威克漢姆酵母屬、毛霉屬、半乳糖酵母屬和根毛霉屬)均為特有優勢真菌屬。花色腐乳和紅方腐乳的共有優勢菌屬僅有雙足囊菌屬，該屬酵母菌能能產生小分子酯和含硫化合物，異丁醇、醛類物質和有機酸等代謝產物[15]。另外，紅腐乳的優勢屬—紅曲霉屬(32.55%)，在花色腐乳中未檢出，可能是在紅方腐乳生產時使用了原料紅曲呈色導致。

腐乳的細菌菌群組成如圖3-c所示。紅方腐乳中有4個優勢菌門：厚壁菌門(Firmicutes，64.25%)，變形菌門(Proteobacteria，26.04%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，7.09%)和放線菌門(Actinobacteria，1.88%)；花色腐乳則有3個：變形菌門(62.58%)，厚壁菌門(29.28%)，擬桿菌門(7.76%)。在屬水平上(圖3-d)，紅方腐乳樣品有4個菌屬的相對含量超過了5%，分別為：乳球菌屬(Lactococcus，21.52%)，明串珠菌屬(Leuconostoc，21.98%)，乳桿菌屬(Lactobacillus，6.05%)和醋酸桿菌屬(Acetobacter，7.21%)，其他優勢菌屬還有：假單胞菌屬(Pseudomonas，2.86%)，不動桿菌屬(Acinetobacter，2.68%)，從毛單胞菌屬(Comamonas，1.83%)，腸球菌屬(Enterococcus，2.36%)，庫特氏菌屬(Kurthia，2.11%)，Fluviicola(2.91%)，魏斯氏菌屬(Weissella，1.77%)，葡萄球菌屬(Staphylococcus，1.55%)和四聯球菌屬(Tetragenococcus，1.77%)。花色腐乳中相對含量超過5%的優勢細菌屬為：假單胞菌屬(47.66%)，乳球菌屬(9.97%)，乳桿菌屬(9.94%)，不動桿菌屬(6.90%)，其他優勢屬還有從毛單胞菌屬(3.11%)，腸球菌屬(1.84%)，庫特氏菌屬(1.27%)，片球菌屬(Pediococcus，2.92%)，鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，2.77%)，類香味桿菌屬(Myroides，2.49%)，Wautersiella(1.94%)。花色腐乳與紅方腐乳的共有優勢菌屬為假單胞菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、不動桿菌屬、從毛單胞菌屬和腸球菌屬。

花色腐乳中的4個特有優勢菌屬為片球菌屬、鞘氨醇桿菌屬、類香味桿菌屬、Wautersiella，其中的鞘氨醇桿菌屬還出現在毛霉型腐乳中[16]，而片球菌出現在白溪腐乳中[17]，類香味桿菌屬和Wautersiella僅出現在農家自制的花色腐乳中[18]，但在市售的醬腐乳、白菜腐乳、青腐乳、紅方腐乳和白方腐乳以及細菌型腐乳中均未檢測到[16-22]，因此可以判斷類香味桿菌屬和Wautersiella是花色腐乳特有的優勢細菌屬。

值得注意的是，花色腐乳與紅方腐乳均無比例超過50%的絕對優勢菌屬，該結果與前人研究一致[19,21-22]。另外，本研究通過多元統計分析表明，花色腐乳與紅方腐乳無論是真菌還是細菌的菌群結構都具有顯著差異(圖2，P<0.05)。但是2種類型腐乳仍然有6個共有優勢細菌屬，它們也作為優勢細菌屬出現在白方腐乳及農家自制的花色腐乳中[18,20]。分析已報道的不同類型腐乳發現，僅乳球菌屬是普遍存在于各種腐乳中的優勢細菌屬[16,20-21]。WAN等[17]通過可培養方法發現，腐乳中的乳球菌為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。乳酸乳球菌能促進食品風味[23]，被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)認為是安全的(Generally Recognized As Safe，GRAS)微生物，常用于食品發酵、藥物生產和飼料添加等，因此該菌可能是在腐乳生產中具有潛在應用價值的乳酸菌種。

進一步通過LEfSe來分析不同類型紅色腐乳中的生物標志物，圖4-a和圖4-b中的柱長度顯示了線性判別值，該值越大，表明其富集程度越高。由圖4可知，有3個優勢真菌屬在紅方腐乳中富集，分別為紅酵母屬、曲霉屬和紅曲霉屬，而毛霉屬在花色腐乳中富集。此外，優勢細菌屬—明串珠菌屬在紅方腐乳中富集，2個非優勢細菌屬—糖芽孢桿菌(Saccharibacillus)和克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)與優勢細菌屬—假單胞菌屬在花色腐乳中富集。由于糖芽孢桿菌和克呂沃爾氏菌屬在花色腐乳中的相對含量低于1%，而毛霉在多種毛霉型腐乳中均有出現，因此紅酵母屬、曲霉屬和明串珠菌屬為紅方腐乳的生物標志屬，而假單胞菌屬為花色腐乳的生物標志屬。這些市售花色腐乳中出現的生物標志屬同樣也出現在農家自制的茨河花色腐乳中[18]。

a-真菌;b-細菌圖4 基于LEfSe分析的腐乳微生物LDA分析Fig.4 Microbial LDA scores plot based on LEfSe analysis

2.2 腐乳VOC分析

花色腐乳與紅方腐乳在菌群結構上差異很大，因此進一步使用GC-IMS定性分析2種腐乳的風味化合物，并建立了菌群與氣味的關聯。由表1可知，共鑒定出30種VOC，包括7種醇類、4種酮類、5種醛類、11種酯類物質，其中酯類物質種類最豐富。

表1 花色腐乳和紅方腐乳的VOC鑒定Table 1 Identification of VOC for red sufu and Huase sufu

進一步通過LEfSe分析發現(圖5)，醛類物質總體上在紅方腐乳中富集，而酮類物質在花色腐乳中含量顯著較高(P<0.05)。具體來說，這些VOC中的乙醇、2-甲基丁醛、2-甲基異丙醛、乙酸甲酯、異丁酸乙酯和丙烯酸在紅方腐乳中顯著富集；另外，乙醛、丙烯酸乙酯、檸檬烯、1-丙醇在花色腐乳中顯著富集，為這2種腐乳各自的特征VOCs。

a-LDA得分圖;b-LDA分支圖圖5 腐乳樣品揮發性有機物的LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis for evaluation of VOCs of sufu samples

2.3 腐乳VOC特征與菌群的關聯分析

普氏分析顯示，腐乳VOC與真菌菌群顯著相關(M2=0.472 4，P=0.041 7)，而與細菌不顯著相關(P=0.417)。因此，我們進一步建立了真菌與風味物質的關聯。

通過圖6分析共找到了28對顯著相關的菌群-VOC關聯(P<0.05)。其中與酯類物質顯著相關的真菌屬有8個：Chalara，Neobulgaria與異丁酸乙酯顯著正相關(P<0.05)；絲孢酵母屬和地霉屬與乳酸乙酯顯著正相關(P<0.05)；曲霉屬與乙酸乙酯顯著正相關(P<0.05)，同時也與丙烯醛極顯著正相關(P<0.01)；威克漢姆酵母屬與丙烯酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸戊酯、丙酸乙酯均呈極顯著正相關(P<0.01)，而與丙酮顯著負相關(P<0.05)，還與2-丁酮顯著正相關(P<0.05)；毛霉和雙足囊菌均與乙酸異戊酯呈正相關(P<0.05)，還與1-戊醇、3-甲基正丁醇、2-戊基呋喃顯著正相關(P<0.05)；此外，毛霉還與1-戊烯-3-醇和乙醛均呈顯著正相關(P<0.05)。因此，真菌與VOC顯示出復雜的關聯，特別是VOC的酯類關聯程度較強。

圖6 腐乳菌群與VOC關聯分析Fig.6 Correlation analysis between VOC and Huase sufu

酯類物質是發酵類豆制品風味物質的主體成分，小分子的酯類物質具有果香與清香特征[24]。本研究使用GC-IMS檢測到的酯類物質種類最多，與以往報道一致[19,25]。乙酸甲酯、異丁酸乙酯在紅方腐乳中顯著較高(P<0.05)，為紅方腐乳的特征性風味酯，而丙烯酸乙酯為花色腐乳中的特性風味酯。值得注意的是，威克漢姆酵母屬在紅方腐乳中為優勢屬，而在花色腐乳中相對含量低于1%，且該菌屬與乙酸甲酯、丙烯酸乙酯顯著正相關(P<0.05)。研究顯示，威克漢姆酵母屬能從啤酒、酸面團、水果、清酒、葡萄酒等發酵食品中分離出，能合成小分子酯類物質，因此推測，威克漢姆酵母屬可能與這2種風味物質有直接關系，或者間接地促進了它們的形成。此外，威克漢姆酵母還能產生糖苷酶，從風味物質前體中釋放小分子風味物質，產生蛋白酶，有助于防止葡萄酒等釀造酒渾濁，還能控制果酒腐敗[26-27]。紅方腐乳特征風味物質異丁酸乙酯的形成可能與優勢屬Chalara和Neobulgaria相關聯。總的來看，與威克漢姆酵母屬以及腐乳初發酵階段的重要微生物毛霉呈正相關的酯類風味物質最多，因此推測它們在腐乳生產中具有較大的開發和應用潛力，可以進一步篩選，用于腐乳生產。

3 結論

茨河花色腐乳的細菌與真菌菌群組成差異顯著，前者的生物標志屬為假單胞菌屬，而紅方腐乳的為紅酵母屬、曲霉屬和明串珠菌屬。盡管2種腐乳的菌群差異較大，但仍然有假單胞菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、不動桿菌屬、從毛單胞菌屬和腸球菌屬為共有優勢細菌屬，其中的乳球菌不僅出現在乳制品、花色與紅方腐乳中，在其他類型的腐乳中也有檢測到，是極具潛在開發能力的菌種資源。茨河花色腐乳與紅方腐乳的共有優勢真菌屬僅有雙足囊菌屬。2種腐乳均含有豐富的VOC，其中小分子酯類VOC種類最多。進一步分析發現，醛類物質在紅方腐乳中富集，而酮類物質在花色腐乳中富集，紅方腐乳的特征風味物質為乙醇、2-甲基丁醛、2-甲基異丙醛等，而花色腐乳的特征風味物質為乙醛、丙烯酸乙酯、檸檬烯等。另外還發現威克漢姆酵母屬和毛霉屬可能參與并促進了腐乳的酯類風味物質的產生，具有進一步在腐乳生產中應用的潛力。