降解草酸鹽益生菌的篩選及其體內功效評價

紀媛媛，馬欣瑩，步雨珊，劉奧，劉同杰，公丕民，張蘭威，易華西

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266000)

腎結石是晶體物質在腎臟異常聚集所引發的疾病[1]，在人群中發病率較高，可達到12%[2]，為泌尿系統的第三大疾病[3]。目前最常用的腎結石治療方法為手術療法，具有見效快、周期短的優點，但極易復發，副作用嚴重，5～10年內，患者復發率可達50%，20年內的復發率甚至可達75%[2]。此外，藥物治療也是比較常用的方法，但治療周期長、見效較慢。因此，需要尋找一種更為有效的預防和控制腎結石的療法。

90%的結石晶體含有鈣，其中以草酸鈣結石最為常見[4]，因此高草酸尿癥也就成為引發腎結石的第一危險因子[5]。這些進入尿液的草酸絕大部分來自外源攝入，小部分來自肝臟內源合成[6]。人體自身無法消化分解草酸鹽，所以外源攝入的草酸在腸道內被吸收，隨血液循環進入尿液。過量的草酸在尿液蓄積，就會引發高草酸尿癥，并伴有草酸鈣晶體形成[7]。如果能夠通過某種手段控制腎臟及尿液中草酸的濃度，減少草酸在腎臟中的蓄積，便可以起到預防腎結石形成的作用。

前期研究發現，某些分離自發酵乳制品、糞便中的乳酸菌具有一定的降解草酸鹽活性[8-10]；進一步動物實驗表明，乳桿菌、雙歧桿菌菌株灌胃后鼠尿草酸含量顯著降低[11-13]。任志華[14]研究發現1株乳酸乳球菌可以降低犬尿鈣和尿草酸的分泌，說明具有降解草酸活性的乳酸菌在動物醫學領域具有廣泛的應用前景。與手術和藥物治療相比，利用乳酸菌等微生態制劑降解草酸鹽來預防腎結石具有獨特的優勢，目前國內外對該方面的研究報道不多。本研究旨在篩選具有高效降解草酸活性的菌株，進一步評估其在小鼠體內的作用功效，探究其基于降解草酸預防腎結石的潛力，為利用益生菌預防或緩解腎結石提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

36株乳酸菌：分離自人體腸道及乳制品，保存于中國海洋大學食品科學與工程學院功能性乳制品與益生菌工程研究室。對照菌株加氏乳桿菌ATCC 33323，中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 實驗動物及飼料

6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；動物飼料，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基、NaCl、草酸、草酸鈉，青島海博生物技術有限公司；TiCl3，國藥集團化學試劑有限公司；PBS緩沖液、草酸試劑盒，北京索萊寶試劑有限公司；肌酸酐(serum creatinine，SCr)試劑盒、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒、檸檬酸ELISA試劑盒、鎂離子試劑盒，上海泛音生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、鈣離子試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；LDZX-75KBS全自動滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SpectraMax190多功能酶標儀，上海美谷分子儀器有限公司；高溫低速組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 降解草酸鹽益生菌的篩選

乳酸菌按照2%(體積分數，下同)的接種量接種至MRS液體培養基中，37 ℃傳代活化2～3次，活化好的菌液按5%的接種量接種至含有5 mmol/ L草酸鈉的MRS培養液(MRS-Ox培養液)中，37 ℃培養5 d，以不接菌的MRS-Ox培養液作為對照組。采用草酸-TiCl3反應法測定培養基中的草酸濃度[15]：取10 mL培養5 d后的MRS-Ox培養液，8 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，再加入1 mL 0.5 mol/L CaCl2溶液靜置沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，烘干離心管中的水分。加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液振蕩混勻，溶解沉淀。再加入新配制的0.25 mL 5%(質量分數)TiCl3溶液，振蕩混勻，測定405 nm波長下的吸光度。根據草酸標準曲線計算草酸濃度，根據公式(1)計算草酸降解率：

(1)

式中：c空白和c接菌分別為空白組和接菌組培養后草酸濃度。

目的菌株培養期間草酸濃度變化的測定：篩選到的菌株傳代活化3次，接入含有5 mmol/ L草酸鈉的MRS培養基，每隔6 h測定培養基中剩余草酸濃度，測定方法同上述草酸-TiCl3反應法[14]，根據測定結果做出草酸濃度隨時間變化規律曲線。

1.3.2 小鼠預灌胃造模實驗及28 d急性毒性實驗

小鼠預灌胃實驗：28只小鼠分成4組，每組7只，其中，對照組、模型組每天灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，低劑量組每天灌胃10 mL/kg低濃度(5×107CFU/mL)菌液；高劑量組每天灌胃10 mL/kg 高濃度(5×109CFU/mL)菌液，預灌胃周期為14 d。

小鼠造模實驗：預灌胃結束后，對照組每天灌胃兩次10 mL/kg PBS緩沖液；模型組每天灌胃上午9時灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，下午3時灌胃10 mL/kg 3%(質量分數，下同)草酸鈉溶液；低劑量組每天上午9時灌胃3%草酸鈉溶液，下午3時灌胃10 mL/kg 低濃度(5×107CFU/mL)菌液；高劑量組每天上午9時灌胃3%草酸鈉溶液，下午3時灌胃10 mL/kg 高濃度(5×109CFU/mL)菌液，周期為28 d。

28 d急性毒性實驗：14只小鼠分為2組，對照組每天灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，灌菌組每天灌胃10 mL/kg，5×107CFU/mL菌液，每天記錄小鼠體重，處死后稱取小鼠腎臟、肝臟質量，計算臟器指數。

1.3.3 小鼠尿草酸含量的測定

收集各組小鼠的尿液，按照試劑盒說明書的方法檢測尿液草酸濃度。

1.3.4 小鼠尿液Mg2+、Ca2+、檸檬酸濃度的測定

收集各組小鼠的尿液，按照試劑盒說明書的方法檢測尿Mg2+、Ca2+、檸檬酸濃度。

1.3.5 小鼠腎臟SOD活性、CAT活性及MDA水平的測定

小鼠處死后取腎臟，按1∶9(g∶mL)的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下，制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明測定SOD、CAT活性、MDA水平。

1.3.6 小鼠血液肌酸酐、尿素氮濃度的測定

小鼠眼球取血，4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定肌酸酐、尿素氮的濃度。

1.3.7 小鼠腎臟組織病理學檢查

小鼠處死后取腎臟，置于10%多聚甲醛固定液中固定組織48 h以上，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法和Von Kossa染色，觀察小鼠腎臟中晶體聚集情況、腎臟病理學變化。

1.3.8 統計學分析

采用SPSS 26.0進行顯著性差異分析(P<0.05)，不同字母表示具有顯著性差異，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 降解草酸鹽益生菌的篩選

以草酸降解率為指標，評估了36株乳酸菌降解草酸的能力，結果如表1所示。不同菌株降解草酸的能力存在明顯差異，乳桿菌1F-6的草酸降解率為83.6%，顯著高于對照菌株加氏乳桿菌(43.9%)，菌株Q7、MN11、YZX21、FN3的降解率均在10%～15%，其余31株菌的草酸降解率均在10%以下。鑒定結果表明，乳桿菌1F-6為Lactobacillusvaginals。

表1 乳酸菌在培養基中的草酸降解率Table 1 Oxalate degrading ability of LAB strains in culture medium

進一步探究了乳桿菌1F-6的草酸降解率隨時間的變化規律，結果如圖1所示。自2.5 d起，培養基內的草酸濃度開始急劇下降，到第5.5天，草酸基本被完全降解，這與KULLIN等[16]報道的Lactobacillusreuteri100-23C從培養初始就降解草酸的變化規律不同，表明不同菌株降解草酸的機制存在差異。乳桿菌1F-6降解草酸可能是其維持生命活動的補救代謝途徑。當培養基中葡萄糖等碳源消耗完畢，乳桿菌1F-6開始利用草酸作為碳源，從而達到降解草酸的目的。以乳桿菌1F-6為候選菌株，開展下一步動物實驗研究。

圖1 1F-6培養過程中草酸濃度的變化Fig.1 Change of oxalic acid concentration during 1F-6 culture

2.2 L.vaginals 1F-6的急性毒性評價

利用小鼠動物模型對乳桿菌1F-6的毒性進行了評價。結果表明，灌胃期間小鼠活動情況、毛色、精神狀態正常，飲水量和攝食量無異常。體重是判定小鼠是否健康的重要指標[17]，體重變化如圖2-a所示。灌胃期間對照組和實驗組小鼠體重均正常增長，無顯著性差異；小鼠肝臟、腎臟等器官也無異常，肝臟、腎臟指數對照與實驗組沒有顯著性差異(圖2-b)。上述結果表明L.vaginals1F-6對小鼠無急性毒性作用。

a-體重;b-臟器指數圖2 灌胃L.vaginals 1F-6對小鼠體重及臟器指數的影響Fig.2 The effects of L.vaginals 1F-6 on body weight and organ index of the mice

2.3 L.vaginals 1F-6降草酸活性體內驗證

2.3.1L.vaginals1F-6對小鼠尿草酸含量的影響

利用動物模型對乳桿菌1F-6的降草酸活性進行了評價研究，結果如表2所示。在整個灌胃期間，對照組小鼠的尿草酸含量基本保持穩定，自第21天起，模型組、低劑量組、高劑量組中的尿草酸含量開始顯著高于對照組(P<0.05)，說明造模成功，且模型組的尿草酸含量增長更快；從28天開始，高劑量組尿草酸含量開始回落，模型組的尿草酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組、高劑量組尿草酸含量均顯著低于模型組(P<0.05)。由上述結果可知，L.vaginals1F-6可有效降低小鼠尿草酸水平，從而預防因攝入過量草酸而引起的高草酸尿癥。

表2 實驗期間小鼠尿草酸含量的變化Table 2 Change of urine oxalate concentration in mice during the experiment

2.3.2L.vaginals1F-6對小鼠尿液Ca2+、Mg2+、檸檬酸水平的影響

尿液中草酸濃度的變化，會破壞離子平衡，進一步引起尿液中其他離子的濃度變化。對乳桿菌1F-6對小鼠尿液中Ca2+、Mg2+和檸檬酸水平的影響進行研究，結果如圖3所示。模型組Ca2+、檸檬酸水平顯著低于對照組(P<0.05)；與模型組相比，L.vaginals1F-6各劑量組的Ca2+、檸檬酸水平顯著升高(P<0.05)，各組Mg2+濃度無顯著性差異。L.vaginals1F-6干預小鼠后，小鼠尿液中的Ca2+、檸檬酸濃度有所回升，且高劑量組和對照組沒有顯著性差異。這可能是由于L.vaginals1F-6降解了進入腸道的草酸，使得尿液排泄出的草酸濃度減小，尿液草酸濃度的降低又進一步影響了尿液中其他離子間的平衡。檸檬酸濃度升高，可與Ca2+結合形成可溶性鹽，從而抑制草酸鈣結石晶體形成[18]。上述結果表明L.vaginals1F-6有助于調控修復草酸引起的尿液離子濃度紊亂。

a-Ca2+濃度;b-Mg2+濃度;c-檸檬酸濃度圖3 L.vaginals 1F-6對小鼠尿液Ca2+、Mg2+、檸檬酸水平的影響Fig.3 Effects of L.vaginals 1F-6 on urine calcium, magnesium, citric acid concentrations in mice

2.3.3L.vaginals1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響

草酸是二元羧酸，屬于強氧化物，具有氧化毒性[17]，過量的草酸極易引發腎臟損傷,影響腎小球的濾過功能，當腎臟嚴重受損時，肌酸酐、尿素氮的濃度也會發生相應的變化[19]，因此肌酸酐、尿素氮是反映小鼠腎功能的重要指標[20]。研究L.vaginals1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響，結果如表3所示。與對照組相比，模型組小鼠血清中尿素氮、肌酸酐含量顯著升高(P<0.05)，說明草酸的連續干預使得小鼠的腎臟濾過功能受到嚴重損傷；與模型組相比，L.vaginals1F-6低劑量組、高劑量組小鼠尿素氮、肌酸酐水平顯著降低(P<0.05)。L.vaginals1F-6可顯著降低小鼠血清中的肌酸酐、尿素氮濃度，小鼠腎臟的濾過功能得到了有效改善，這與GOMATHI等[21]的實驗結果一致。

表3 L.vaginals 1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響Table 3 Effects of L.vaginals 1F-6 on blood urea nitrogen, creatinine concentrations in mice

2.3.4L.vaginals1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響

MDA濃度，SOD、CAT活性是衡量組織氧化損傷情況的指標[20]。對L.vaginals1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響進行了研究，結果如圖4所示。

a-MDA含量;b-SOD活性;c-CAT活性圖4 L.vaginals 1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響Fig.4 Effects of L.vaginals 1F-6 on renal MDA level and SOD, CAT activities in mice

與對照組相比，模型組SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)、MDA濃度顯著升高(P<0.05)，表明高濃度草酸的攝入使得小鼠腎組織受到嚴重的氧化損傷；與模型組相比，L.vaginals1F-6各劑量組的SOD、CAT活性均顯著增加(P<0.05)，且高劑量組SOD、CAT活性與對照組無顯著性差異(P>0.05)，各劑量組MDA濃度相比于模型組也得到顯著降低(P<0.05)。L.vaginals1F-6通過降低進入腎臟中的草酸濃度，減弱了草酸對腎臟的氧化損傷作用，并使小鼠腎臟功能恢復到原有水平，表明L.vaginals1F-6可有效緩解由草酸過量積累導致的腎功能氧化損傷。

2.3.5L.vaginals1F-6對小鼠腎臟組織形態的影響

利用HE染色法研究了L.vaginals1F-6對小鼠腎臟組織形態的影響，結果如圖5-a所示。對照組小鼠腎臟未觀察到草酸鈣沉積、腎小管擴張的現象；模型組小鼠腎組織結構紊亂，管腔擴張嚴重，管腔內可明顯觀察到草酸鈣晶體的聚集；相比于模型組，L.vaginals1F-6低、高劑量組的腎臟損傷有所緩解，低劑量組晶體沉積明顯減少，高劑量組在視野內幾乎無草酸鈣晶體出現。

a-HE,400×;b-Von Kossa，200×圖5 不同染色法各組小鼠腎臟組織病理學檢查結果Fig.5 Renal histopathological examination of mice in different groups under different stainings

Von Kossa染色法是對鈣結晶的特異性染色[22]，可以更直觀地觀察到腎組織中草酸鈣的聚集情況。Von Kossa染色結果如圖5-b所示，對照組未觀察到鈣結晶的形成，模型組、低劑量組、高劑量組均可觀察到腎小管管腔中的黑色染色結晶，且模型組結晶數量明顯高于L.vaginals各劑量組，高劑量組效果最好，僅有少量草酸鈣結晶分布于管腔。上述結果表明，L.vaginals1F-6可有效緩解由草酸過量積累導致的腎組織損傷。

3 結論

隨著中國經濟的發展，人們膳食結構的改變，動物蛋白和脂肪攝入量的增多，我國高草酸尿癥的發病率逐漸增加。草酸的過飽和是高草酸尿癥乃至腎結石等形成的重要因素。目前針對高草酸尿癥的治療主要為利尿劑、鎂劑等方法，但改善作用均為暫時性緩解，不能有效防止或預防高草酸尿癥的形成。膳食補充劑干預是最簡單有效的措施。本研究以草酸降解率為指標，篩選出1株草酸降解率為83.6%的乳桿菌L.vaginals1F-6，其草酸降解率顯著高于現有報道，利用高草酸尿癥小鼠模型進一步系統評估了L.vaginals1F-6體內降解草酸的作用功效，L.vaginals1F-6可顯著降低小鼠尿草酸含量、減少小鼠腎臟內的草酸鈣晶體積累，調控草酸引起的尿液離子濃度失衡，緩解草酸濃度導致的腎氧化等功能損傷，表明L.vaginals1F-6可以在腸道內定植，對攝入小鼠體內的草酸起到了降解作用，從而使進入尿液和腎臟的草酸有所減少，減少腎臟草酸鈣晶體聚集，有效緩解小鼠腎功能損傷，起到保護腎臟的作用。