乳雙歧桿菌XLTG11對小鼠免疫功能的影響

馬微微，李玟玟，馬青，張振華，黃莉莉

(黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱，150040)

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，能產生確切的健康功效從而改善宿主微生態平衡。近年來，我國對益生菌的研究不斷深入，益生菌產業已成為我國食品工業中增長較快、創新密集的產業[1]。雙歧桿菌是益生菌研究和使用的主要對象之一，也是人體空腸中發現的最為重要的細菌，其數量可隨著腸道延伸不斷增加，在腸道中其他菌的數量也與雙歧桿菌的生長直接相關[2-3]。乳雙歧桿菌XLTG11是1株分離自健康嬰兒腸道具有優良益生特性的雙歧桿菌，目前國內外對于乳雙歧桿菌XLTG11的免疫調節作用未見報道。本實驗使用環磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)建立免疫抑制模型小鼠，通過檢測模型小鼠的全血白細胞數目、血清溶血素水平(HC50值)和脾淋巴細胞亞群百分比，探討乳雙歧桿菌XLTG11對宿主體液免疫和細胞免疫功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6～8周齡健康SPF級雄性BALB/c小鼠(18～22 g)，遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物飼養于屏障環境動物室，期間自由飲水、攝食，溫度控制在20～23 ℃，12 h明暗交替；乳雙歧桿菌XLTG11菌粉，葵花藥業集團股份有限公司；注射用CTX凍干粉，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；鹽酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride，LEV)，山西太原藥業有限公司；綿羊紅細胞(sheep red blood cell，SRBC)、都氏試劑和SA緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；補體(豚鼠血清)，玉環市南方試劑有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和膠原酶Ⅳ(>160 U/mg)，美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)和中性蛋白酶(50 U/mg)，北京索萊寶科技有限公司；小鼠熒光單抗CD3-FITC(100203)、CD4-APC-Cy5.5(100433)、CD8a-PE(100707)和CD19-APC(115512)，安諾論(北京)生物科技有限公司。

MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌器、MDF-382E -80 ℃冰箱，日本Panasonic公司；SORVALL ST8/8R低溫離心機，美國TOMOS公司；NovoCyte3110流式細胞儀，美國Agilent公司；SMATBCD Synergy MX全自動酶標儀，美國BIOTEK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及受試樣品給予

所有動物操作均按照黑龍江中醫藥大學《實驗動物管理條例》進行，實驗經黑龍江中醫藥大學動物倫理委員會批準(倫理審批代碼：2020110401)。BALB/c小鼠適應性飼養7 d后，隨機分為空白組、CTX組、LEV組、4個乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組，共計7組，每組8只。各組小鼠于每日上午8點半分別灌胃給予生理鹽水(空白組和環磷酰胺組)，LEV(鹽酸左旋咪唑組，10 mg/kg)，以及乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×106、2.5×107、2.5×108和2.5×109CFU/mL組)，連續給予28 d。除空白組外，其余各組小鼠分別于灌胃的第23，24天腹腔注射CTX(40 mg/kg)，建立免疫功能低下模型。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 白細胞總數的測定

在末次給藥0.5 h后，采集小鼠眼球全血，加入含有抗凝劑的離心管中，用全血細胞分析儀檢測白細胞總數。

1.2.2.2 血清溶血素的測定

于灌胃給予后第24天，各組小鼠腹腔注射體積分數2%的SRBC 0.2 mL進行免疫。5 d后，即灌胃給予的第28天，摘除眼球取血于離心管內，放置約1 h，2 000 r/min離心10 min，收集血清，將血清與生理鹽水按1∶100體積比稀釋。具體步驟參考文獻[4]，最后使用全自動酶標儀測定各孔混合溶液光密度值。溶血素的量以半數溶血值(HC50)表示，HC50計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2.3 脾淋巴細胞亞群百分比檢測

末次給藥0.5 h后，頸椎脫臼處死小鼠，分離脾臟放入生理鹽水中清洗，用濾紙去掉多余水分，立即放入組織保存液中待用。

單細胞懸液制備：將小鼠脾臟剪碎，使用酶混液消化，37 ℃孵育1 h，加入10% FBS，研磨過濾后于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解2 min后于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入適量PBS，重懸沉淀，于4 ℃離心5 min，棄上清液，洗滌1～2次。最后用100 μL的PBS重懸細胞沉淀后進行染色。

流式細胞儀檢測脾淋巴細胞膜表面標志物：將CD3-FITC、CD19-APC、CD4-APC-Cy5.5和CD8a-PE表面抗體按照一定的稀釋比例加入細胞懸液中，4 ℃避光孵育30 min，染色后的細胞于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入500 μL的PBS重懸細胞沉淀，過0.22 μmol/L濾網后上機。擇通道FITC、APC、PE和PerCP/Cyanine 5.5，上機1×105個細胞，進行分析。結果以CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+的百分比表示乳雙歧桿菌XLTG11對小鼠脾淋巴細胞亞群的影響。

1.2.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 白細胞總數的測定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量對CTX小鼠全血白細胞(white blood cell,WBC)總數的影響如圖1所示。與空白組比較，CTX組小鼠白細胞總數顯著降低(P<0.001)。與CTX組比較，LEV組小鼠全血白細胞總數增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌(2.5×109CFU/mL)組小鼠全血白細胞總數顯著增加(P<0.01)。

圖1 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠全血白細胞數目的影響Fig.1 Effect of different doses of XLTG11 on total white blood cell of CTX mice 注:*** P<0.001，與空白組相比；#P<0.05，## P<0.01，與模型組相比

2.2 血清溶血素的測定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量對CTX小鼠HC50的影響如圖2所示。與空白組比較，CTX組小鼠HC50值顯著降低(P<0.001)。與CTX組比較，LEV組小鼠HC50值增加(P<0.01)，乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×106CFU/mL)和(2.5×107CFU/mL)組小鼠HC50值增加(P<0.05)，XLTG11(2.5×108CFU/mL)和(2.5×109CFU/mL)組小鼠HC50值顯著增加(P<0.001)。

圖2 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠HC50的影響Fig.2 Effect of different doses of XLTG11 on HC50 of CTX mice 注:*** P<0.001，與空白組相比；#P<0.05，##P<0.01, ##P<0.001，與模型組相比

2.3 脾淋巴細胞亞群百分比的測定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組對CTX小鼠脾淋巴細胞亞群百分比的影響如表1和圖3所示。與空白組比較，CTX組小鼠脾淋巴細胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比均明顯降低(P<0.05)。與CTX組比較，LEV組小鼠脾淋巴細胞CD3+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比明顯增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌XLTG11各劑量組小鼠脾淋巴細胞CD3+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比顯著增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×109CFU/mL)組小鼠脾淋巴細胞CD19+百分比增加(P<0.01)。

表1 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠脾淋巴細胞亞群百分比的影響 單位：%Table 1 Effect of different doses of XLTG11 on percentage of splenic lymphocyte subsets of CTX mice

a-CD4+CD8-和CD4-CD8+ T淋巴細胞；b-CD19+ T淋巴細胞圖3 流式細胞技術檢測各組小鼠脾淋巴細胞亞群百分比Fig.3 Percentage of splenic lymphocyte subsets of mice in various groups detected by flow cytometry注：A-空白組；B-模型組；C-LEX組；D-XLTG11(2.5×106 CFU/mL)組；E-XLTG11(2.5×107 CFU/mL)組；F-XLTG11(2.5×108 CFU/mL)組；G-XLTG11(2.5×109 CFU/mL)組

3 討論

免疫系統是機體內一系列生物學結構和進程所組成的疾病防御系統，是人體健康的保障[5]。隨著人們生活節奏加快，普遍人群免疫力低下，據世界衛生組織數據顯示，全球約75%的人都處于亞健康狀態[6]，亞健康影響人們的生活，降低生活質量。因此，提高機體免疫力尤為重要。研究表明，腸道內的益生菌可以直接或間接地刺激機體免疫系統成熟，影響機體單核細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞功能，提高機體免疫力[7-8]。

本實驗結果顯示，乳雙歧桿菌XLTG11在2.5×106CFU/mL時可以增加免疫低下小鼠的HC50值，提高脾淋巴細胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比。作為保健食品攝入體內的益生菌在機體復雜的消化系統面前，其存活率大大降低，在體內存活時間變短，不能達到預期的健康功效[9]，面對此問題往往通過加大劑量實現益生菌的增免作用。然而，乳雙歧桿菌XLTG11具有優良益生特性，其在pH 8.0的人工消化液中消化11 h，存活率仍然高達89.75%，能夠以活的狀態進入人體腸道發揮健康功效。因此，乳雙歧桿菌XLTG11在相對較低濃度2.5×106CFU/mL時，表現出免疫增強作用。

本實驗研究結果表明，40 mg/kg CTX連續腹腔注射2 d可顯著降低小鼠全血白細胞總數和HC50值。在灌胃給予28 d不同劑量乳雙歧桿菌XLTG11后，乳雙歧桿菌XLTG11各劑量組小鼠的血清溶血素水平明顯提高。乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×109CFU/mL組)小鼠的血液白細胞數目明顯增加。白細胞數目與機體非特異性免疫功能密切相關，血清溶血素的含量可以反映小鼠特異性體液免疫功能。以往研究表明，一種由雙歧桿菌為主要成分的益生菌可以明顯增加健康小鼠的血液白細胞數目[10]。雙歧桿菌菌株BifidobacteriumadolescentisBB-2 和BifidobacteriumlongumBB-3可以增高健康小鼠的血清溶血素吸光值，且隨著劑量升高，溶血素含量逐漸增強[11]。綜上可見，乳雙歧桿菌XLTG11具有增強小鼠非特異性和特異性免疫功能的作用，且具有劑量依賴性。

T淋巴細胞是特異性免疫的主要效應細胞，其細胞膜表面分子與T細胞功能相關，用以分離鑒定不同亞群。T淋巴細胞按表面分化抗原不同(cluster differentiation，CD)大致分為具有協助細胞免疫和體液免疫功能的輔助性T細胞 (helper T cell, Th) 以及具有殺傷靶細胞功能的細胞毒性T細胞 (cytotoxic T lymphocyte, Tc)。T淋巴細胞亞群相互協作，反映機體免疫調控狀態和免疫水平，是免疫調節的關鍵所在[12-13]。CD3+分子是T淋巴細胞標志物, 按照T淋巴細胞表面抗原決定簇不同分為CD4+CD8-T淋巴細胞和CD4-CD8+T淋巴細胞2個亞群[14]。CD4+CD8-T淋巴細胞為Th型淋巴細胞，參與細胞因子分泌，促進B淋巴細胞、T淋巴細胞和其他免疫細胞增殖分化，發揮固有免疫應答作用。CD4-CD8+T淋巴細胞為Tc型淋巴細胞，具有特異性殺傷功效和細胞毒作用，可殺傷靶細胞[15-16]。CD4+CD8-和CD4-CD8+T淋巴細胞與細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α呈正相關關系[17]。CD19+參與B淋巴細胞發育再生，在成熟B淋巴細胞分化為合成和分泌抗體的漿細胞過程中，其表面CD19+丟失，并可發生免疫球蛋白的類別轉換，被激活的B細胞膜表面表達和分泌的免疫球蛋白類別從產生IgM轉換為產生IgG、IgA或IgE，升高血清中免疫球蛋白IgA和IgG表達水平，發揮體液免疫調節功能[18]。本實驗研究結果顯示，乳雙歧桿菌XLTG11對CTX致免疫低下小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群平衡具有調節作用，可提高小鼠脾臟T淋巴細胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比。這與本實驗前期研究結果相一致，即乳雙歧桿菌XLTG11可以提高小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG和細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平，參與小鼠特異性免疫應答作用調節。另有研究表明，乳雙歧桿菌M8可提高大鼠全血CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞及NK細胞百分比[19]。包含多種乳雙歧桿菌的復合益生菌可拮抗CTX造成的小鼠免疫低下狀態，提高CD4+和CD8+T淋巴細胞占脾細胞的比例，減少脾淋巴細胞凋亡[20]。因此，推測乳雙歧桿菌XLTG11可通過刺激T淋巴細胞增殖分化，發揮其增強小鼠細胞與體液免疫的能力。

綜上可見，乳雙歧桿菌XLTG11因其具有良好穩定性和腸道耐受性，相對較低濃度亦具有增強免疫作用，在益生菌保健食品開發方面具有成本低的優勢。目前對于乳雙歧桿菌的增強免疫作用機制研究多集中在腸道壁壘和腸道菌群等方面，乳雙歧桿菌XLTG11表現出明顯的免疫增強作用，今后可對其進行全面評價，為益生菌保健食品的開發提供藥理學基礎。