蛋白質高產株小球藻MBFJNU-17的異養培養基優化

周有彩，肖雪花，梁志波，何勇錦,2，陳必鏈,2*

1(福建師范大學 生命科學學院，福建 福州，350117)2(工業微生物教育部工程研究中心(福建師范大學)，福建 福州，350117)

小球藻(Chlorellasp.)富含蛋白質、色素、多種脂肪酸和淀粉，是食品、醫藥和能源產品的優質來源[1- 2]。當前，小球藻的全球年產量可達2 500 t，但仍處于供不應求的局面[3]。原因在于，小球藻的培養主要是利用開放池和光反應器2種形式，這種通過吸收光能的自養培養模式存在很多弊端，如培養周期長、產量低和采收成本高等問題[4]。為填補市場缺口，微藻生產商只能通過加大用地面積，加大培養規模來提高產量。而擴培手段又無法從根本上解決小球藻培養成本高和產率低的問題，如何經濟高效地培養小球藻一直都是學者和生產商的研究熱點。

研究發現，部分小球藻可以利用有機碳源來獲取能量以提供自身細胞代謝合成，進行異養生長。與光自養相比，異養培養的小球藻菌株能有效利用葡萄糖，極大提高生長速率，獲得更高的產量[5]。小球藻異養培養過程中，培養基的組成及用量是影響細胞生長的關鍵因素[6-7]。適合的培養基往往能使小球藻具有較快的生長速率以及高的細胞密度[8]。因此通過優化培養基的組分及用量既可以降低小球藻的生產成本又可以提高產量。然而，小球藻細胞在異養條件下通常產生低蛋白質(<40%)和高脂肪/碳水化合物含量的生物量[9-10]。為有效地提高異養小球藻的蛋白質含量，研究人員開發了一些有效的工藝來促進微藻的蛋白質合成，如串聯異養/自養培養法[11]和氮饑餓-過度補償法[12]。但這些工藝具有過程繁瑣、培養時間長以及成本昂貴等弊端，因此需要探索更為簡單、有效的方法。

本文用實驗室保藏的1株小球藻MBFJNU-17，研究不同氮源對微藻細胞生長及生理生化的影響，并對小球藻生長培養基關鍵影響成分的用量進行優化，對小球藻的細胞組分進行分析，評估蛋白質的氨基酸品質，旨在為開發優質的動物飼料或人類食品蛋白質來源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養基

小球藻Chlorellasp.MBFJNU-17，由本實驗室保藏。保種斜面瓊脂培養基為添加了5 g/L葡萄糖和20 g/L瓊脂的BG11[13]培養基。

HA-SK培養基[11](g/L)：葡萄糖 30、MgSO4·7H2O 0.7、CaCl25 mL/L、Fe-EDTA 16 mL/L、KNO39.25、KH2PO40.7、微量元素母液2.5 mL/L，配制完成后將pH調節至7.5。

Fe-EDTA母液：稱取Fe2SO4·7H2O 1.745 g、EDTA 8.2 g，溶于少量蒸餾水后定容至1 L。

CaCl2母液：無水CaCl220.6 g，H2O 1 L。

微量元素母液(g/L)：H3BO311.42、ZnSO4·7H2O 8.22、MnCl2·4H2O 1.95、Co(NO3)2·6H2O 0.49、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.870 7、CuSO4·5H2O 1.57。

所有培養基使用前于115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 儀器

SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學研究院；海能K9840全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；BS224S電子秤，北京賽多利斯系統儀器有限公司；HVE50高壓蒸汽滅菌鍋，中遠機械有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；H1650-W湘儀離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DELTA320 pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；IS-RDS3恒溫振蕩搖床，賽伯樂上海儀器有限公司。

1.2.2 試劑

酵母粉，索萊寶生物科技有限公司；蛋白胨粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；KNO3、尿素，西隴科學股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藻種制備

從葡萄糖BG11培養基斜面挑取適量小球藻體，接種于裝有100 mL HA-SK培養基的250 mL錐形瓶中，置于28 ℃恒溫振蕩搖床中培養，搖床轉速為150 r/min，培養時長約72 h。

1.3.2 小球藻生長曲線的繪制

取培養至72 h的新鮮小球藻種子液，以體積分數為10%的接種量接入HA-SK培養基，與藻種相同條件下培養，培養時長168 h，每天取樣測定生物量，并繪制其生長曲線。

1.3.3 氮源種類的優化

根據HA-SK培養基的初始氮含量，探究相同氮質量濃度(以總氮分子質量計)的4種不同氮源對小球藻細胞生長以及生物質組分的影響，即KNO3(9.25 g/L)、酵母粉(9.21 g/L)、蛋白胨粉(9.21 g/L)和尿素(2.8 g/L)，篩選出小球藻MBFJNU-17異養培養的最適氮源。將小球藻MBFJNU-17藻種以10%的接種量，接種于裝有100 mL不同氮源HA-SK培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩搖床中培養。培養溫度為28 ℃，搖床轉速為150 r/min，黑暗條件下培養5 d。每天測定培養液的pH，并測定最終的小球藻生物量、蛋白質、碳水化合物以及油脂等理化組分。

1.3.4 響應面優化

以Plackett-Burman設計法[14]，設計以培養基中葡萄糖、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2母液、Fe-EDTA母液和微量元素母液為不同因素，在原始HA-SK培養基各因素濃度的附近取高低2個水平，其中高水平為低水平的2倍，并以小球藻培養120 h的生物量為響應值，篩選出HA-SK培養基成分中對小球藻MBFJNU-17生長最重要的幾個因素。隨后用最陡爬坡來快速逼近各重要因素最佳用量的區域。最后再利用響應面法[15]優化得到各培養基的最佳用量。

1.4 分析測試

1.4.1 小球藻生物量的測定

采用干重法測定小球藻的生物量。取1 mL的小球藻藻液，移至預先烘干稱重的2 mL離心管中，離心棄上清液，加純水重復離心，洗滌3次，置于80 ℃烘箱內至恒重，稱重并記錄。

1.4.2 小球藻生物質主要成分的分析

采用凱氏定氮法測定微藻蛋白質含量[16]。采用苯酚硫酸法測定微藻的碳水化合物含量[17]。采用氯仿-甲醇法測定微藻細胞的油脂含量[18]。

1.4.3 蛋白質中氨基酸組成測定及品質評價

采用高效液相色譜法測定小球藻蛋白質的氨基酸組分[19]。利用必需氨基酸指數(essential amino acids index，EAAI)評價小球藻的蛋白質營養價值，將小球藻MBFJNU-17的必需氨基酸與FAO /WHO的建議模式進行比較[20]。

1.4.4 培養基氮含量計算

培養基氮含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ(N)，培養基中氮含量，g/L；m，氮源質量，g；Pn，氮源的總氮占比，%；L，培養基體積，L。

2 結果與分析

2.1 小球藻 MBFJNU-17生長曲線

由圖1可知，小球藻MBFJNU-17種子接入HA-SK培養基后快速生長，迅速進入指數生長期，幾乎沒有延滯期。培養至96 h，小球藻的生物量達最大值9.32 g/L；96～168 h，不再增加，甚至輕微衰減。可能是此時培養體系內某些影響小球藻細胞生長的關鍵營養成分被消耗，殘余量不足以繼續供應細胞正常的生長繁殖，整個細胞群體的凋亡速度大于新細胞合成速度。因此，選擇以培養120 h為1個周期。

圖1 小球藻MBFJNU-17在HASK培養基的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella sp.MBFJNU-17 cultivated in HA-SK medium

2.2 小球藻培養基氮源的篩選

氮源是微藻培養中最重要的常量營養元素，藻細胞的蛋白質、色素和核酸合成都需要氮元素參與。由圖2-a可知，以尿素為氮源小球藻MBFJNU-17培養120 h后生物量最高(10.85 g/L)，KNO3組為9.44 g/L。而以蛋白胨、酵母粉為氮源的實驗組小球藻生物量遠低于尿素組和KNO3組，最終生物量僅約3 g/L。表明小球藻MBFJNU-17不能很好地利用酵母粉和蛋白胨等有機氮源，而更傾向于利用尿素和KNO3。肖雪花等[21]發現，酵母粉更適于作為蛋白核小球藻異養培養的氮源，與本研究結果不一致，可能是因為藻的種間差異。而利用尿素為氮源比以KNO3為氮源的細胞干重略有優勢，主要是由于小球藻在選擇利用尿素時，脲酶將尿素分解成氨態氮和CO2，過程不需要消耗能量[22]，而利用硝態氮時需轉化為氨態氮才能被利用，這個過程需要多消耗能量，造成有機碳源的損耗[23]。

a-生長情況；b-pH；c-理化成分圖2 不同氮源對小球藻MBFJNU-17的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on Chlorella sp.MBFJNU-17

圖2-b記錄了以不同氮源培養異養培養小球藻MBFJNU-17過程的pH變化情況。以尿素為氮源，小球藻培養液的pH始終在7.5左右。可能是因為尿素是分子式為CH4N2O的有機化合物，其主要成分為碳和氮，在被微藻吸收利用后，不會殘留大量陰離子和陽離子，因此不會影響培養基的pH。而以KNO3、蛋白胨和酵母粉為單一氮源則使培養液pH變化較大。其中以蛋白胨、酵母粉為氮源，培養小球藻120 h后，培養液的pH從7.5降至約6，而KNO3組的藻液pH迅速升高，升至9.5左右。KNO3作為微藻培養的氮源時，微藻對NO3-的吸收比K+更多，因此有部分K+殘留在培養基質中生成K2CO3等弱酸強堿鹽，升高了培養環境的pH值。而酵母粉和蛋白胨粉作為有機氮源成分相對復雜，其影響微藻培養pH值的機制尚不清楚，今后還需更多地利用多組學技術來闡述其代謝活動。據報道，培養液pH值的變化會影響小球藻生長[24]。SHI等[25]發現在同等氮濃度下，尿素作為氮源在藻類生長過程中優于常用的硝酸鹽，在培養基中引起的pH波動小，藻類的生物量相對較高，這與本研究結果相似。

另外，氮源的種類對小球藻MBFJNU-17的理化成分影響顯著。如圖2-c所示，以尿素和KNO3為氮源更有利于蛋白質的合成(40%～45%)，而以蛋白胨和酵母粉為氮源則更有利于油脂的積累(30%～35%)。

綜上可得，以KNO3或尿素為唯一氮源時，有利于小球藻細胞生長。此外，對生物量、蛋白質含量和氮源添加量進行計算可知，獲得相同生物量的小球藻時，所需的KNO3質量約為單獨使用尿素的3.8倍，且利用KNO3獲得的小球藻蛋白質產量僅為使用尿素為唯一氮源時的81.2%。同時，在以尿素為唯一氮源時也更有利于穩定培養液的pH。小球藻在規模化異養培養過程中，若頻繁調節pH勢必會增加操作工序和培養成本，也更容易造成染菌。根據調查，尿素的市場價格也會比KNO3的價格更低[26]。因此后續培養小球藻MBFJNU-17選取尿素作為異養培養的氮源，可以減少物料的投入成本，同時無需調節培養液的pH，易于規模化應用。

2.3 小球藻異養培養基配方優化

2.3.1 Plackett-Burman優化小球藻培養基

選取小球藻培養基里的葡萄糖、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2母液、Fe-EDTA母液、KH2PO4和微量元素母液7類組分為自變量，每個因素設計高低2個水平，以培養120 h的小球藻生物量作為響應值。實驗結果見表1。在眾多因子中，葡萄糖、尿素和微量元素母液顯著影響(P<0.05)小球藻MBFJNU-17的生長。其中葡萄糖和尿素為正效應(T>0)，而微量元素母液為負效應(T<0)。

表1 Plackett-Burman試驗設計方差分析表Table 1 Analyses of variance for Plackett-Burman design

2.3.2 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman選取最顯著的3個因素，即葡萄糖、尿素和微量元素母液，進行最陡爬坡試驗。由于葡萄糖和尿素是正效應，而微量元素母液為負效應，因此葡萄糖和尿素的濃度水平應增加，微量元素母液濃度水平應減少。根據效應值大小，確定步長，設計及結果如表2。試驗組3的小球藻生物量最大，達15.25 g/L。因此選取試驗組3的水平條件作為中心點進一步通過響應面優化最佳濃度水平。

表2 最陡爬坡試驗設計及其結果Table 2 Designs and result of steepest ascent search

2.3.3 響應面分析確定最優水平

根據最陡爬坡試驗結果，選取葡萄糖40 g/L、尿素5 g/L、微量元素母液2 mL為中心點。參照Box-Behnken中心法則設計原理，通過Design-Expert 8.05軟件設計3因素3水平的響應面試驗，以生物量為響應值，設計和數據分析見表3、表4和表5。

表3 響應面設計因素及水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

表4 響應面設計及結果Table 4 Results of response surface Box-Behnken design

用Design-Expert 8.05b 軟件對試驗進行回歸擬合分析，得到響應值小球藻細胞干重與各自變量因素的二次回歸方程如下：

Y=15.48+0.74X1-0.44X2-0.30X3-0.16X1X2-0.23X1X3+0.46X2X3-0.87X12-0.80X22-0.70X32

為檢驗方程的有效性，對回歸方程進行方差分析，結果見表5。回歸方程響應值和自變量因素之間的線性關系顯著(R2=0.989 9)，方程P=0.009 1，說明此回歸方程極顯著；失擬項P=0.380 3>0.1，說明方程對實驗的擬合度較好，此實驗方法是合適的[12]。為求得最佳配方，通過對模型方程各變量求一階偏導數，解得X1=41.53、X2=4.14、X3=1.84。即小球藻細胞生長干重的最佳葡萄糖濃度為41.53 g/L、尿素質量濃度為4.14 g/L、微量元素母液用量為1.84 mL，在此條件下的小球藻細胞干重為15.79 g/L。

表5 回歸方程的系數估計值Table 5 The regression equation of coefficient estimates

2.3.4 響應面結果驗證

將經過優化后的培養基以相同接種量、培養條件進行3次重復試驗，以驗證此模型精準性。如圖3-a所示，在優化后的培養基中培養120 h，小球藻MBFJNU-17最終生物量為15.53 g/L，與預測值15.79 g/L接近，比優化前提高了43.1%，說明此優化模型可取。

a-細胞生長變化；b-生化組成分析圖3 優化后培養基培養小球藻MBFJNU-17的細胞生長變化和生化組成分析Fig.3 Changes of cell growth and biochemical composition of Chlorella sp.MBFJNU-17 treated by optimized medium

優化后培養基培養的小球藻生化組分分析見圖3-b。優化后的小球藻蛋白質含量達52.4%，淀粉含量22.7%以及油脂含量為7.8%。利用優化后的培養基培養小球藻MBFJNU-17，蛋白質含量從44.5%提高到了52.4%。說明優化后的培養基配方在保證了小球藻MBFJNU-17生物量提高的同時，也促進了細胞蛋白質合成。說明培養基優化后，小球藻MBFJNU-17成為生產高密度生物量且富含蛋白質的理想菌株。

2.4 小球藻蛋白質的評價

蛋白質的營養品質與氨基酸的含量、比例相關，特別是由各類必需氨基酸的濃度決定[27]。本文采用EAAI對小球藻MBFJNU-17在自養(BG11培養基培養)和異養2種培養模式下的氨基酸組成進行比較分析和評價。高EAAI值表明樣品存在高含量的必需氨基酸[28]。如表6所示，異養小球藻MBFJNU-17蛋白質在FAO/WHO/UNU模式下的EAAI為0.724，高于自養模式培養的藻蛋白質(0.572)。可能原因是，異養培養基中豐富的營養元素使得小球藻MBFJNU-17更容易合成必需氨基酸。同時，異養小球藻MBFJNU-17蛋白質的EAAI值也高于大豆蛋白(0.657)。說明異養小球藻MBFJNU-17蛋白比大豆蛋白具有更高的營養價值，有可能成為優質的動物飼料或人類食品蛋白質來源。

表6 異養/自養小球藻蛋白與大豆蛋白在FAO/WHO/UNU模式下EAAI 單位：mg/g蛋白Table 6 Compared heterotrophic/phototrophic Chlorella sp. MBFJNU-17 protein with soya protein in essential amino acid index (EAAI) in FAO/WHO/UNU standard

3 結論

本研究通過單因素試驗選取了尿素作為小球藻MBFJNU-17異養培養的氮源。相比于其他氮源，用尿素作為氮源異養培養小球藻能具有最高生物量，且培養過程pH穩定，更具應用前景。小球藻MBFJNU-17異養培養的培養基經優化后，其生物量為15.53 g/L，比優化前提升了43.1%，同時藻細胞的蛋白質含量為52.4%。氨基酸評價分析表明，小球藻MBFJNU-17蛋白質氨基酸組成平衡，比大豆蛋白具有更高的營養價值，小球藻MBFJNU-17有成為優質的動物飼料或人類食品蛋白質原料來源的潛能。