離子液體預處理/硫酸水解協同制備納米纖維素及其穩定Pickering乳液初步研究

張書敏，劉玥，劉洪龍，張宇昊，陳媛，余永，戴宏杰*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715)

納米纖維素(nanocellulose,NC)是指一維尺度上具有納米尺寸(<100 nm)的纖維素材料，具有高比表面積、高長徑比、低熱膨脹系數、高機械強度、易修飾、無毒性、可降解等優異特性，在食品領域如乳液穩定劑、包裝膜、食品調節劑、凝膠和載體材料等方面受到廣泛關注[1-2]。根據纖維素來源、形貌和制備方法，納米纖維素可分為細菌納米纖維素(bacterial nanocellulose, BNC)、纖維素納米晶體(cellulose nanocrystals, CNC)和纖維素納米纖絲(cellulose nanofibrils, CNF)[3]。目前制備CNC的方法主要是酸水解法，此外氧化法、酶解法的研究也較多；而制備CNF的方法主要是機械法(如球磨、超聲和高壓均質等)[4-5]。其中通過無機酸水解(主要包括硫酸、磷酸和鹽酸)是制備CNC的最常用方法，獲得的CNC具有較好的穩定性且尺寸相對均一，但在制備過程中存在酸溶液濃度過高(如常用的硫酸質量分數64%，磷酸質量分數85%和鹽酸質量分數37%)的問題，不僅生產成本高，且易產生工業廢水污染環境并對機器造成耗損腐蝕；此外，酸水解法制備CNC還存在得率較低的缺點[6]。而機械法制備CNF耗時較長，能耗高，機器磨碎嚴重且易堵塞或升溫，同時獲得的納米纖維素形貌均一性較差[7]。因此，研究納米纖維素的高效穩定制備方法具有重要意義。

離子液體是指在室溫或接近室溫下呈現液態的、完全由陰陽離子所組成的鹽類物質，具有出色的溶解能力、高熱穩定性、可回收性及低毒性等特性，是纖維素溶解和加工的“綠色溶劑”[8-9]。MAO等[10]采用酸性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽([Bmim][HSO4])在120 ℃條件下處理微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC)制備得到CNC。本課題組前期研究發現，以離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯化物([BMIM]Cl)為球磨介質和檸檬籽纖維素為原料，可制備CNF，同時球磨介質中的[BMIM]Cl含量能夠調控納米纖維素結構[7]。有研究表明，通過離子液體對纖維原料進行預處理，可以削弱原纖維素內部的氫鍵并破壞其內部結構，增加纖維素分子的反應可及性[11]。因此，對于酸水解制備納米纖維素而言，過高的酸濃度是產品工業化生產的主要瓶頸。通過離子液體預處理，提高其在較低濃度硫酸溶液中的水解程度，進一步促進納米化效率和提高產品得率具有一定的可行性和巨大潛力。

相較于表面活性穩定的傳統乳液，固體顆粒穩定的Pickering乳液由于固體顆粒在界面處的不可逆吸附而具有高穩定性(抗奧氏熟化)、界面和結構可調控等特點，在食品領域受到廣泛關注[5]。作為最廣泛的生物質資源，納米纖維素具有良好的生物相容性、兩親性和獨特的納米結構，在構建食品級Pickering乳液中具有極大潛力，如脂肪替代物、3D打印食品和營養載體等方面的應用[12-13]。基于以上研究背景，本研究以MCC為原料，采用離子液體預處理/硫酸水解協同制備納米纖維素，考察不同質量分數硫酸溶液對納米纖維素結構的影響，同時探究其在穩定Pickering乳液方面的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

微晶纖維素，上海源葉生物科技有限公司；葵花籽油，佳格投資有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽、[Bmim]Cl)離子液體、中科院蘭州化學物理研究所；NaCl，重慶川東化工有限公司；H2SO4、HCl、NaOH，成都市科隆化學品有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XHF-DY高速分散器、JY 92-IIN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BX53立式顯微鏡，日本OLYMPUS公司；PE 20實驗室酸度計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R臺式高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；FD-1-50冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；Spectrun 100紅外光譜儀，美國鉑金埃爾默股份有限公司；ZEN3690納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司；Nano Man VS原子力顯微鏡，美國Bruker公司；X’Pert3 Powder10300 X射線衍射儀，荷蘭帕納特儀器有限公司；TGA550熱重分析儀，美國TA公司。

1.3 納米纖維素的制備

取2 g MCC和60 g離子液體[BMIM]Cl進行混合，置于90 ℃的油浴鍋中攪拌2 h進行預處理，然后加入60 mL不同質量分數的硫酸(10%、20%、30%和40%)，超聲破碎均勻后，再置于90 ℃的油浴鍋中繼續水解3 h，然后加入5倍體積蒸餾水終止反應，用蒸餾水多次離心(5 000 r/min，5 min)洗滌以除去殘留的酸液和離子液體，收集懸浮液超聲(300 W，10 min)并在蒸餾水中透析72 h(4 ℃)，獲得納米纖維素懸浮液并測定其得率，部分樣品冷凍干燥用于結構表征。根據制備過程中使用的硫酸溶液質量分數分別命名納米纖維素為NC10%、NC20%、NC30%和NC40%。

1.4 結構表征

1.4.1 Zeta電位測定

準確配制質量濃度為1 g/L的納米纖維素懸浮液，采用馬爾文儀器測定其Zeta電位值。測定溫度為室溫，每個樣品重復測定3次。

1.4.2 原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)

將納米纖維素懸浮液(0.2 g/L)滴在新鮮剝離的云母片上，室溫干燥2 h后通過原子力顯微鏡觀察其形貌。用Nano measure1.2軟件進行納米纖維素樣品長度和直徑的測量。

1.4.3 傅立葉轉換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)

將干燥的樣品和溴化鉀按質量比1∶70研磨混合均勻后進行壓片，用紅外光譜儀對其進行紅外光譜分析，測量的波長為4 000～400 cm-1。

1.4.4 X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)

采用X射線衍射儀表征微晶纖維素和納米纖維素的結晶結構。掃描范圍為10°～50°，掃描速度0.02 °/s。其中，纖維素Ⅰ型和Ⅱ型晶體結構的比例計算如公式(1)所示[14]：

(1)

式中：I22.7為2θ=22.7°衍射峰強度；I20.4為2θ=20.4°衍射峰強度。

1.4.5 熱失重分析(thermogravimetric analysis，TGA)

通過熱重分析儀對樣品進行熱失重分析，實驗中選取的測試溫度為20～500 ℃，升溫速度為10 ℃/min，氣體環境N2，氣流速度為20 mL/min。

1.5 納米纖維素穩定Pickering乳液研究

1.5.1 Pickering乳液的制備

取一定體積的納米纖維素溶液于10 mL離心管中，然后加入一定量的葵花籽油，用高速分散器在9 000 r/min下均質1 min得到新鮮乳液，密封放置于4 ℃冰箱備用。考察乳液制備過程中納米纖維素質量濃度(1.0～5.0 g/L)和油相體積分數(30%～70%)以及乳液不同儲藏時間(1和7 d)對乳液微觀結構的影響。

1.5.2 乳液微觀結構觀察

采用光學顯微鏡觀察。吸取20 μL的乳液樣品于干凈載玻片上，輕蓋蓋玻片，防止液滴破裂，在10倍鏡下觀察乳液液滴大小。

2 結果與分析

2.1 納米纖維素得率和穩定性

如圖1所示，通過離子液體預處理/硫酸水解制備納米纖維素時，其得率隨硫酸溶液質量分數的增加而逐漸降低，但仍能達到30%以上，高于常規酸水解法。硫酸質量分數的增加導致氫離子的濃度增加，使得無定型區的氫鍵破壞，無定型區纖維素水解生成水溶性糖類物質[15-16]。納米纖維素懸浮液(2 g/L)在室溫下靜置1 h后，NC10%和NC20%出現明顯分層，而NC30%和NC40%則保持較好的靜置穩定性，無分層現象發生。一般來說，當電位絕對值趨于25 mV時，粒子之間靜電作用力增強，納米纖維素懸浮液趨于穩定[17]。Zeta電位分析結果表明NC30%和NC40%電位絕對值均接近30 mV，而NC10%和NC20%電位絕對值相對較低(<20 mV)。這是由于硫酸溶液質量分數的增加有利于硫酸與纖維分子中的羥基酯化形成酯基，從而增加納米纖維素懸浮液的電位絕對值，進而提高納米纖維素的穩定性和分散性，最終導致納米纖維素懸浮液體系越來越穩定。當前研究表明，通過離子液體預處理，在相對較低的硫酸質量分數(<64%)下也能獲得穩定的納米纖維素懸浮液，其得率高于常規酸水解法。

圖1 納米纖維素懸浮液的靜置穩定性、Zeta電位和得率Fig.1 The static stability, Zeta potential and yield of the obtained nanocellulose suspension

2.2 AFM分析

由圖2可以看出，隨著硫酸溶液質量分數的增加，納米纖維素的形態發生明顯變化。NC10%呈現纖絲狀網絡結構，其直徑和長度分別為(18±8) nm和(1 500±246) nm；NC20%仍呈現一定程度的相互纏結網絡結構，其直徑增加至(23±7) nm，長度減少至(680±85) nm；但NC30%形貌發生明顯變化，呈現短纖絲結構，網絡結構明顯減弱，其直徑繼續增加至(35±10) nm，長度減少至(280±55) nm；繼續增加硫酸溶液質量分數至40%時，獲得的NC40%呈短棒狀，其直徑和長度分別為(50±8)和(150±25) nm。總體上，隨著硫酸溶液質量分數的增加，納米纖維素形態從長纖絲狀結構變為短棒狀結構且直徑逐漸增加。在離子液體預處理/硫酸水解協同制備納米纖維素過程中，調節硫酸溶液濃度能夠調控納米纖維素的形態結構，這對納米纖維素的應用具有重要意義。

圖2 納米纖維素的AFM圖Fig.2 AFM images of the obtained nanocellulose

2.3 XRD分析

圖3為MCC和納米纖維素的XRD圖譜。MCC在2θ=15.01、22.57、34.61 °處出現明顯的衍射峰，分別對應纖維素(1-10)/(110)、(002)和(004)晶面，屬于纖維素Ⅰ型晶體結構的特征衍射峰[18]。經過離子液體預處理/硫酸水解后，制備的納米纖維素晶體結構發生明顯變化，屬于(002)晶面的衍射峰強度明顯降低，但2θ=20.28°處屬于(110)晶面的衍射峰強度明顯增加，表明納米纖維素的無定型結構增加。此外，納米纖維素在2θ=12.37°出現一個新的衍射峰，屬于纖維素I和II型晶體結構共存衍射吸收峰，表明存在I型向纖維素Ⅱ型晶體結構的轉變現象[16,19-20]。MCC中纖維素Ⅰ型與Ⅱ型晶體結構的比例為2.22，隨硫酸溶液濃度增加，納米纖維素的纖維素Ⅰ型與Ⅱ型晶體結構的比例為0.81～0.91。這主要是由于離子液體預處理能夠破壞MCC之間的氫鍵作用，導致纖維素原有晶體結構的破壞和轉變，纖維素II型晶體結構增加；而硫酸溶液濃度增加導致纖維素無定型區水解增加，進而Ⅰ型晶體結構相對增加[21]。

圖3 MCC和納米纖維素的XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of MCC and the prepared nanocelluloses

2.4 FT-IR分析

圖4為MCC和納米纖維素的FT-IR圖譜。由圖4可以看出，MCC和制備的納米纖維素在3 400 cm-1左右處均存在纖維素中O—H的伸縮振動吸收峰，但是納米纖維素中O—H吸收峰強度較MCC相對降低，這是由于離子液體預處理過程中纖維素氫鍵結構部分斷裂[22]。此外，在2 904和1 429 cm-1處分別為C—H的伸縮振動和彎曲振動峰，1 635 cm-1處的吸收峰與吸收水的O—H基團彎曲振動有關，1 065 cm-1處為吡喃糖環中的C—O—C伸縮振動吸收峰，895 cm-1處為β-糖苷鍵的特征吸收峰。以上特征峰在所有納米纖維素中都存在，表明離子液體預處理/硫酸水解制備納米纖維素過程沒有破壞纖維素的結構[23]。此外，制備的納米纖維素在2 904、1 635、1 429 cm-1處的峰強度均明顯低于MCC，說明盡管纖維素的分子結構沒有發生改變，但是晶體結構和氫鍵遭到破壞，這與XRD分析結果一致。

圖4 MCC和納米纖維素的FT-IR圖譜Fig.4 FT-IR spectra of MCC and the prepared nanocelluloses

2.5 熱穩定性分析

圖5為MCC和制備的納米纖維素的TG和DTG曲線。所有樣品在100 ℃以下出現輕微的重量損失，這是樣品中吸附水或結合水的質量損失造成的[21]。在200～400 ℃所有樣品均出現了大量的質量損失，這與纖維素自身受熱分解有關，對應DTG曲線上280～350 ℃出現的最大降解峰。繼續升高溫度，在400 ℃以上的質量損失是纖維素的進一步高溫碳化造成的。MCC的初始降解和最大降解溫度分別為294、333 ℃，NC10%、NC20%、NC30%和NC40%的初始分解溫度分別為262、260、257、251 ℃，最大降解溫度分別為321、310、310和300 ℃，其初始分解溫度和最大降解溫度均隨硫酸溶液質量分數的增加而降低，且均低于MCC，這是由于離子液體預處理后增加酸質量分數將降低納米纖維素聚合度和結晶度，同時增加無定形區酯化度造成的[24]。當溫度達到500 ℃時，MCC的殘余量為6.60%，而隨硫酸溶液質量分數增加納米纖維素殘余質量明顯增加(10.24%～12.53%)。硫酸溶液質量分數的增加導致納米纖維素中磺酸基團逐漸增加，其具有阻燃作用，導致高溫后納米纖維素殘余質量增加[25]。

圖5 MCC和納米纖維素的TG和DTG曲線Fig.5 TG and DTG curves of MCC and the prepared nanocelluloses

2.6 穩定Pickering乳液性能分析

2.6.1 不同納米纖維素濃度下穩定的Pickering乳液

圖6為固定油相體積分數為40%，不同納米纖維素質量分數穩定的Pickering乳液在4 ℃下儲存1和7 d后的光學顯微鏡圖片。對于NC20%、NC30%和NC40%，隨著納米纖維素質量分數逐漸增加，所制備乳液的粒徑逐漸減小。這主要是因為固體顆粒質量分數的增加導致更多顆粒可以吸附到油滴表面，形成緊密的網狀層和界面膜結構，有效防止了乳滴之間聚集現象，最終形成較小尺寸的乳滴，也降低了發生奧氏熟化的幾率[26]。乳液放置1周后，乳液液滴尺寸變化較小，表明當前制備的乳液具有較好的儲存穩定性。這主要是由于納米纖維素穩定的乳滴之間的靜電作用和空間排斥作用，使其具有良好的穩定性[27]。但是NC10%在1 g/L時形成的乳液出現很多細小液滴，儲藏1周后細小液滴減少且乳液液滴不明顯，這可能是NC10%在油滴表面的吸附程度較弱，此時液滴之間的空間排斥作用較低，導致其不能形成穩定的界面層造成的；此外，NC10%在3～5 g/L下穩定的乳液，粒徑也相對較大。相比NC10%，NC20%、NC30%和NC40%穩定的乳液具有更好的儲藏穩定性和更小的乳液粒徑，這可能是更高的硫酸質量分數導致納米纖維素具有更好的懸浮穩定性和適宜的尺寸造成的，其更有利于顆粒吸附和乳液界面穩定[28]。總體來看，NC40%在不同質量分數下均具有最小的乳液粒徑，穩定乳液效果較好。

圖6 不同納米纖維素濃度下穩定的Pickering乳液的光鏡圖片Fig.6 Optical images of Pickering emulsions stabilized by the prepared nanocelluloses with different concentrations

2.6.2 不同油相質量分數下納米纖維素穩定的Pickering乳液

圖7是固定納米纖維素質量濃度為5 g/L，在不同油相體積分數(30%～70%)下制備的Pickering乳液在4 ℃下儲存1和7 d后的光學顯微鏡圖片。隨著油相比例的增加，所有乳液的粒徑逐漸增加，但均保持較好的油滴形狀，說明制備的納米纖維素在質量濃度5 g/L下能穩定較高油相比例的乳液。隨著油相比例的增加，此時連續相中的納米纖維素不足以穩定大量的油滴，此時通過增加液滴的碰撞頻率，以達到減少界面總面積從而維持穩定，減少液滴凝聚的可能，最終形成較大尺寸的乳液液滴[29]。對比不同納米纖維素穩定的乳液，NC10%穩定的乳液液滴尺寸相對較大，尤其是在高油相比例下(>60%)；而NC20%、NC30%和NC40%穩定的乳液隨油相體積分數增加(30%～70%)，其乳液粒徑也逐漸增加，但均小于NC10%。所有乳液在貯藏7 d后液滴保持完整，具有較好的儲藏穩定性。而NC40%穩定的乳液的粒徑僅在高油相下(>60%)增大，具有更好的乳化性能和乳液穩定性。

圖7 不同油相濃度下納米纖維素穩定的Pickering乳液的光鏡圖片Fig.7 Optical images of Pickering emulsions stabilized by the prepared nanocelluloses with different oil phase ratio

3 結論

本研究以MCC為原料，采用離子液體預處理/硫酸水解協同制備納米纖維素。研究發現調節硫酸溶液質量分數能夠對納米纖維素結構進行調控，包括電位值、形貌、晶體結構和熱穩定性。隨著硫酸溶液質量分數增加(10%～40%)，納米纖維素從長纖絲狀結構變為短棒狀結構，晶體結構發生變化；其初始分解溫度和最大分解溫度均降低，但高溫殘余量較高，具有較好的阻燃性能。當前制備的納米纖維素均能有效穩定Pickering乳液，且隨著硫酸溶液質量分數的增加，制備的納米纖維素在不同顆粒質量分數和不同油相比例下穩定乳液性能提升，乳液粒徑逐漸降低且乳液儲藏穩定性增加。本研究提供了一種有效制備納米纖維素基Pickering穩定劑的方法，可降低傳統酸水解制備納米纖維素的酸質量分數并提高產品得率。后續研究應重點探究納米纖維素在油水界面的分布和環境條件對乳液穩定性的影響，揭示其穩定Pickering乳液機制。