牦牛酥油乳脂肪球膜蛋白分離純化和蛋白組鑒定及功能分析

談婷，羅毅皓，孫萬成

(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016)

牦牛酥油主要以牦牛乳為原料加工而成，其脂肪含量約為87.77%，蛋白質含量僅為1.98%[1]。乳脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)具有三層膜結構[2]，乳脂球表面是一層厚10～20 nm的薄膜[3]。MFGM蛋白在MFGM中分布不對稱，含量為奶牛MFGM的25%～60%，是乳中蛋白質總量的1%～2%[4]。MFGM蛋白主要組成有黏蛋白1(mucin1, MUC1)、嗜乳脂蛋白黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)、乳脂球表皮生長因子8、組織糖蛋白高碘酸薛夫6/7、脂肪酸轉運體蛋白(CD36)、脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein, FABP)和脂肪細胞分化相關蛋白(adipocyte differentiation related proteins, ADRP或ADPH)等[5]。

目前國內外對乳中蛋白質分離純化的研究有很多。采用DEAE-52離子交換層析和SephadexG-100凝膠層析可分離純化驢乳乳清中蛋白質[6]。通過鈉離子磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水，結合聚乙二醇辛基苯基醚溶液分離得到乳中MFGM蛋白[7]。用Tris-HCl緩沖液及DEAE SepharoseTMFast Flow離子交換柱從牛奶酪蛋白膠束中分離純化β-酪蛋白和κ-酪蛋白[8]。利用樹脂及SephadexG-1 50 層析分離純化出牛奶中XDH/XO[9-10]。NGUYEN等[11]采用非標記定量液相色譜串聯質譜法技術對水牛乳和牛乳MFGM蛋白質組進行比較，篩選出220個水牛乳MFGM蛋白質和234個牛乳MFGM蛋白質。李墨翰等[12]通過蛋白質組學研究驢初乳和驢常乳差異蛋白組，在驢初乳和驢常乳中分別鑒定到216和215種MFGM蛋白。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合液質聯用在人初乳MFGM蛋白中鑒定出1 076種蛋白，在牛初乳MFGM蛋白中鑒定出682種蛋白[13]。

目前國內外對MFGM蛋白質的研究多以乳汁為原料，研究其蛋白質組成和功能特性，對酥油中MFGM蛋白的研究鮮有報道。在青藏高原上，酥油多為牧民家庭手工制作，方法較為多樣，可以將牛奶加熱熬煮，上層為酥油(粗酥油)，下層為乳清和奶渣；或者可以將牛乳靜置發酵成全脂酸乳，對酸乳進行上下捶打直到出現脂肪球，加熱熬煮浮出酥油[14-15]。酥油制作時將牦牛乳中大部分乳清排除，以酥油為原料提取MFGM蛋白可以在一定程度上減少乳清蛋白對提取結果的干擾，為此本論文利用牦牛酥油提取其MFGM蛋白，并進行純化，再利用液質聯用對純化前后蛋白進行鑒定，將鑒定后的結果通過基因本體(Gene Ontology, GO)功能注釋以及KEGG場景進行分析，對MFGM蛋白組成和潛在功能進一步挖掘，為后期深入研究酥油MFGM蛋白提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酥油，青海省河南蒙古族自治縣牧民家。

Real Band蛋白預染Marker、3kDa超濾管、costar 96孔板，上海生工生物工程股份有限公司；溴酚藍，上海廣諾化學科技有限公司；考馬斯亮藍R-250、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，福州飛凈生物科技有限公司；甘氨酸、SDS、Tris、曲拉通X-100，北京索萊寶科技有限公司；福林酚、牛血清白蛋白V(bovine serum albumin,BSA)、Na2CO3、CuSO4、酒石酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、KCl、KH2PO4、NaCl、蔗糖，天津市河東區紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設備

Q Exactive Plus液相色譜質譜聯用儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；AKTA pure 25蛋白質純化系統、DEAE-Sepharose FF(DEAE瓊脂糖凝膠)，美國GE公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell凝膠垂直電泳系統、GelDoc XR System凝膠成像系統，美國伯樂公司；5424臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；ESJ110-413電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；HH-6水浴鍋，常州市金壇友聯儀器研究所；PHS-3C 型pH計，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化及組分分析

1.3.1.1 牦牛酥油MFGM蛋白提取

參照文獻[7]的方法，略有修改。用pH為7.4的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水對牦牛酥油中乳脂肪粗提物洗滌，加入體積分數為3.4% 的聚乙二醇辛基苯基醚溶液和2.6%的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液溶解MFGM上的脂質而得到MFGM蛋白。

1.3.1.2 MFGM蛋白含量測定

用福林酚法(Lowry法)測定蛋白質含量。紫外可見雙光束分光光度計在 500 nm 下比色測定，以 BSA 為標品制作標準曲線[16]。

1.3.1.3 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化

利用AKTA pure 25M蛋白質純化系統階躍梯度法洗脫。將MFGM蛋白用PBS稀釋成2 mg/mL備用，用PBS平衡層析柱10個柱體積，取樣品溶液500 μL上樣，用PBS清洗陰離子交換柱，再用洗脫液進行洗脫，不同濃度NaCl洗脫液占比為30%、50%、80%，收集峰值處的溶液，放于離心管標記貯藏[17]。

1.3.1.4 階躍梯度洗脫法提取MFGM蛋白FABP 3正交實驗

根據單因素實驗結果，以FABP 3得率為指標，通過L16(44)正交試驗，考察PBS的pH、洗脫液濃度、洗脫流速、洗脫體積對FABP 3得率的影響，確定FABP 3最優純化工藝。

1.3.1.5 SDS-PAGE

本研究通過SDS-PAGE根據分子質量大小對蛋白質進行分離，用5% 的濃縮膠和8% 的分離膠制作底膠，采用Tris-甘氨酸-SDS 為電泳緩沖液，分離膠采用25 mA電流，濃縮膠提高電流至35 mA。結束后用考馬斯亮藍R-250 染色1～2 h，再用脫色液脫色直至底膠清晰，采用Bio-Rad凝膠成像系統和image.lab軟件以獲得最優圖像并拍照分析。

1.3.1.6 質譜檢測及數據分析

質譜分析由邁維代謝公司完成。質譜分析使用Thermo公司的Q Exactive Plus液質聯用系統進行。樣品通過納升流速的液相UltiMate 3000 RSLCnano系統進行分離。肽段樣品經過上樣緩沖液溶解，富集到C18捕獲柱(3 μm, 120 ?， 100 μm×20 mm)，再經分析柱(2 μm, 120 ?, 75 μm×150 mm)分離。利用2個流動相(流動相A:3% DMSO, 0.1%甲酸, 97% H2O和流動相B:3% DMSO, 0.1%甲酸, 97% ACN)建立分析梯度。液相的流速設置為300 nL/min。質譜DDA模式分析時，每個掃描循環中包含一個MS全掃描，以及隨后的15個MS/MS掃描。HCD碰撞能量28；四級桿的篩選窗口1.6 Da；離子重復采集的動態排除時間35 s。

1.4 計算公式

MFGM蛋白得率按公式(1)計算：

(1)

式中：YMFGM，牦牛酥油MFGM蛋白得率，%；mMFGM，提取的MFGM蛋白凍干粉質量，g；m，原料酥油質量，g。

MFGM蛋白質含量按公式(2)計算：

(2)

式中：WMFGM，牦牛酥油MFGM蛋白含量，%；C1，福林酚測得蛋白質濃度，mg/mL；C0，MFGM蛋白粗品質量濃度，mg/mL。

AKTA pure 25M系統配有UV檢測器，在洗脫過程中會形成紫外吸收曲線和紫外吸收峰。FABP 3含量按公式(3)計算：

(3)

如公式(4)(5)(6)所示，由朗伯-比爾定律可得：

(4)

CMFGM=0.1 g/50 mL=2 mg/mL

(5)

(6)

式中：YFABP 3，FABP 3得率，%；CFABP 3，所收集組分中FABP 3的質量濃度，mg/mL；A，組分平均紫外吸收，AU；S，紫外峰面積，由ATKA pure 25M系統自動積分算出，mL×mAU；V1，所收集組分的體積，mL；V2，上樣量0.5 mL；d，UV紫外流通池長度，cm，根據AKTA pure 25M系統說明書，d=0.2 cm；Ext.coef，在使用波長下蛋白的消光系數。

經Uniprot數據庫查詢FABP 3(序列號：E5G7E7)，再經過ExPASy工具輸入該蛋白氨基酸序列算出FABP 3在280 nm下的消光系數為0.946 [L/(g·cm)]。

將公式(1)(2)(3)(4)整理得到公式(7)(8)：

(7)

(8)

式中：C總，FABP 3在牦牛酥油中的質量濃度，mg/mL；V酥油，酥油融化的體積，mL；mMFGM，酥油粗提MFGM蛋白的總質量，mg。

1.5 數據處理與分析

使用SPSS 26.0進行方差分析；Q Exactive Plus產生的質譜數據通過MaxQuant (V1.6.2.10)進行檢索，采用的數據庫檢索算法是MaxLFQ。檢索使用的數據庫是Uniprot中Bos的蛋白質組參考數據庫。

2 結果與分析

2.1 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化及組分分析

2.1.1 牦牛酥油MFGM蛋白含量

將MFGM蛋白用蒸餾水溶解成2 mg/mL溶液后，用Lowry法測定蛋白質含量，以BSA為標準品，得到標準曲線y=0.001 4x+0.005 4,R2=0.993 2。根據公式(2)計算MFGM蛋白含量為22.28%。蛋白含量較低，表明MFGM蛋白提取后仍殘留一些MFGM其他成分如磷脂、鞘磷脂、甘油三酸酯、膽甾醇及鹽類[18]。

2.1.2 階躍梯度洗脫法提取MFGM蛋白FABP 3正交試驗

在單因素試驗的基礎上，為綜合考慮各因素對牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3得率的影響，進行正交試驗確定最佳的純化工藝條件，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表L16(44)Table 1 Orthogonal experiment factors and levels L16 (44)

表2 正交試驗結果表Table 2 Results of orthogonal test

對正交試驗結果進行極差分析，如表3所示。各因素對牦牛酥油MFGM蛋白中FABP 3的提取效果影響次序為：RD>RA>RC>RB，即洗脫體積對牦牛酥油MFGM蛋白中FABP 3的提取效果影響最大，再依次是緩沖液pH、洗脫速度和洗脫液濃度。FABP 3的最優提取工藝組合為A2B1C3D2，即洗脫體積為50 mL，緩沖液pH為7.4，洗脫速度為1.6 mL/min，洗脫液濃度為0.50 mol/L時，該條件下，FABP 3的得率達83.19%。

表3 FABP 3提取正交試驗方差分析表Table 3 FABP 3 extraction of orthogonal test variance analysis table

F檢驗結果表明，洗脫體積、緩沖液pH、洗脫液濃度、洗脫速度對MFGM蛋白FABP 3提取得率影響差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 FABP 3得率及濃度計算

利用AKTA pure 25M蛋白純化系統，結合陰離子交換柱對牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3洗脫純化。陰離子交換柱交換基質由帶正電荷的樹脂或纖維素組成，其交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，這類蛋白質被吸附在柱子上，通過提高洗脫液中鹽濃度等措施將吸附在柱子上的蛋白洗脫下來[19]。FABP 3等電點是6.73，將MFGM蛋白用pH 7.0的PBS溶解，使目標蛋白帶負電荷上樣后被吸附在柱子上，洗脫時進一步調整洗脫A液PBS的pH提高洗脫得率。洗脫條件選擇和AKTA pure 25M操作方法在孫琳[17]研究基礎上略有改動。

如圖1利用AKTA pure 25M系統進行純化操作。待柱平衡后，將V2體積的MFGM溶液注入AKTA pure 25M系統進行洗脫，洗脫過程中出現3個紫外吸收峰，第1個紫外峰為流穿峰，所收集的組分為雜蛋白[17]；經SDS-PAGE證實，第2個紫外吸收峰為目的蛋白形成的洗脫峰，即所收集的組分是FABP 3；第2個紫外吸收峰的面積為S，代入公式(7)和公式(8)，得到FABP 3得率和酥油中FABP 3的濃度。

圖1 階躍梯度洗脫層析圖Fig.1 Step gradient elution chromatogram

2.1.4 粗提MFGM蛋白質和純化MFGM蛋白組分分析

2.1.4.1 SDS-PAGE法分析MFGM蛋白質組分

取等量的粗提MFGM蛋白和純化后的MFGM蛋白，用分離膠濃度為8%、濃縮膠濃度為5%的變性聚丙烯凝膠電泳分析樣品中的蛋白質組成，結果如圖2所示。

圖2 MFGM蛋白經SDS-PAGE結果圖Fig.2 SDS-PAGE results of MFGM protein

本研究粗提酥油MFGM蛋白鑒定出7個電泳條帶，根據相關文獻研究結果[20-22]，和蛋白marker條帶根據分子質量大小比對，從上至下，第1個條帶顯示蛋白可能是RAB11家族相互作用蛋白5(RAB11FIP 5)、肌球蛋白IG(JAK1)、受體蛋白酪氨酸激酶(MYO1G)和酪氨酸蛋白激酶(EPHB 3)。其中MFGM蛋白主要有FABP 3、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G(i) α-1(GNAI 1)、蛋白質NDRG2和脂肪細胞相關蛋白(ADPH)4種。粗提和純化蛋白均在13 kDa處都形成了較明顯的區代(圖2)，與FABP 3理論分子質量一致。粗提MFGM蛋白質中還含有部分未除去的酪蛋白、乳球蛋白和乳白蛋白。MFGM蛋白經AKTA pure 25M純化后，去除了部分酪蛋白和乳清蛋白以及脂肪細胞相關蛋白(ADPH)和分子質量位于100 k～140 kDa的高分子質量蛋白，顯著提高了牦牛酥油FABP 3的純度。

2.1.4.2 LC-MS/MS分析MFGM蛋白組分

樣品經質譜檢測共鑒定到以FABP 3、脂蛋白脂肪酶、α-S1-酪蛋白、肌動蛋白，細胞質 1、L-乳酸脫氫酶、β-乳球蛋白、乳轉鐵蛋白等為主的31種蛋白。純化后蛋白主要是FABP 3。

根據表4，粗提和純化MFGM蛋白主要是 α-S1-酪蛋白和FABP 3，經iBAQ處理，粗提MFGM蛋白FABP 3含量為20.005%，純化MFGM蛋白FABP 3含量為13.542%。

表4 iBAQ定量主要蛋白結果展示Table 4 Demonstration of iBAQ quantitative analysis of major proteins

2.1.4.3 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白熱圖分析

熱圖分析結果如圖3所示，純化后脂肪球膜蛋白種類變少，說明在純化過程中去除了轉錄調節因子等17種蛋白，純化前后高豐度蛋白主要是α-S1-酪蛋白和FABP 3，其中FABP 3是MFGM蛋白中一種膜蛋白。

圖3 粗提和純化MFGM蛋白熱圖分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram of crude and purified MFGM protein注：紅色表示蛋白表達量高；藍色表示蛋白表達量低；每列表示一次重復試驗，每行表示一個蛋白質

李瑋軒[20]在驢初乳和常乳中鑒定到61種差異性表達MFGM蛋白。本實驗中粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白差異蛋白種類見表5，其中列出了主要的17種差異蛋白，少于驢初乳和驢常乳差異性表達蛋白種類。

表5 粗提和純化MFGM蛋白中的差異蛋白Table 5 Differential expressed protein of crude and purified MFGM protein

2.1.4.4 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白GO注釋

如圖4所示，從生物過程、細胞組分、分子功能分析所有31種粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白，用GO功能注釋分析對所有蛋白進行注釋，分子功能富集分析中有22種蛋白主要富集在結合作用；28種蛋白在細胞解剖學實體組分內高度富集；有22種蛋白主要參與生物調節過程。

圖4 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白GO功能注釋圖Fig.4 Functional annotation of GO terms crude and purified MFGM protein

如圖5所示，對粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白20種差異蛋白進行GO注釋，參與的主要生物過程有生物調節、刺激反應、多細胞組織化過程、代謝過程等16類。在分子功能富集分析中，差異MFGM蛋白主要富集在結合作用、催化活性、分子功能調節器、轉運等6類分子功能中。此外MFGM蛋白主要在細胞、細胞解剖學實體、細胞內等5類細胞組分內高度富集。以往研究表明MFGM蛋白可以通過上調Akt和mTOR蛋白激酶的表達，顯著促進細胞生長，抑制C2C12細胞凋亡[23]。酥油MFGM蛋白GO注釋分析可為MFGM蛋白生物學具體作用機制研究提供參考。

a-生物學過程(BP);b-細胞組成(CC);c-分子功能(MF)圖5 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白GO注釋Fig.5 GO annotation of the differential protein between crude and purified MFGM protein

對篩選的差異蛋白進行了3個層級3個類別的GO注釋。生物學過程(biological process，BP)，細胞組成(cellular component，CC)與分子功能(molecular function，MF)的二級GO注釋結果如圖5所示。

2.1.4.5 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白差異蛋白KEGG通路分析

20種差異蛋白參與的前15條通路如圖6所示，參與的代謝途徑分別是內質網中蛋白質加工、軍團桿菌病、抗原的處理和表達、弓形蟲病、吞噬體、程序性細胞壞死、代謝信號轉導通路、麻疹、長壽調節通路-多個物種、甲型H1N1流感、雌激素信號通路、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒感染、內噬作用、阿爾茲海默癥、糖異生作用。其中差異蛋白參與最多的通路是內質網中蛋白質加工，FABP 3參與與免疫相關的過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)信號通路[24]。

圖6 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白KEGG通路分析圖Fig.6 KEGG pathway analysis diagram of crude and purified MFGM protein

2.1.4.6 參與內質網中蛋白質的加工相關的蛋白及KEGG通路分析

由表6可知，通過在線KEGG通路檢索，牦牛酥油MFGM差異蛋白中有3種蛋白參與內質網中蛋白質的加工。

表6 參與內質網中蛋白質的加工KEGG通路的蛋白Table 6 Proteins involved in the processing of the KEGG pathway for proteins in the ER

由圖7可知，紅色標注代謝物上調，藍色標注代謝物下調。3種蛋白質在該通路中調控代謝物甘露糖寡糖a-1,3-葡萄糖苷酶上調進一步誘導凝集素的形成和去糖基化，進而調控蛋白質在內質網中的加工，進一步運輸至高爾基體中對蛋白質加工；通過下調分子伴侶HtpG和熱休克70 kDa蛋白1/2/6/8，進而抑制內質網相關降解過程。

圖7 內質網中蛋白質的加工Fig.7 Protein processing in endoplasmic reticulum

2.1.4.7 參與PPAR信號通路相關的蛋白及KEGG通路分析

KEGG代謝通路分析得出，牦牛酥油MFGM差異蛋白參與PPAR信號通路的蛋白質是FABP 3。

通過在線KEGG通路檢索，牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3參與內分泌系統——PPAR信號通路。PPAR是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體[25]。PPAR 有3種亞型(PPARα、β/δ和γ)，它們分別編碼在一個單獨的基因中，并結合脂肪酸和類花生酸[26]，參與脂質代謝和炎癥的控制，并在所有主要細胞類型的動脈粥樣硬化病變中表達[27]。PPARα通過調節肝臟和骨骼肌中脂質代謝蛋白的基因表達，在清除循環或細胞脂質中發揮作用，控制許多參與細胞脂肪酸進入和氧化的基因的表達，在正常和病變心臟能量代謝基因調控中發揮作用[28]。PPARβ/δ參與脂質氧化和細胞增殖。推測FABP可以通過PPARγ促進脂肪細胞分化以提高血糖攝取[29]。

由圖8可知，FABP的表達誘導肝臟骨骼肌、骨骼肌脂肪細胞、脂肪相關代謝物表達，進而使PPAR在3種亞型中均被不飽和脂肪酸和9-順式-視黃酸激活后通過識別特異的核苷酸序列并與之結合來啟動和調控FABP 3和FABP 4的表達。推測FABP 3可能參與其中與脂肪酸降解、膽汁酸合成、甘油磷脂代謝相關的類脂物代謝作用，FABP 4參與脂肪細胞分化，但并未通過該數據庫查找到具體作用位點。為進一步探究脂肪酸結合蛋白3的作用位置和參與途徑提供參考。

圖8 PPAR信號通路Fig.8 PPAR signaling pathway

同時FABP的表達誘導了3種亞型PPAR信號通路的代謝，在a-亞型通路中，PPARα被不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、類十二烷酸、纖維化藥物、非甾體抗炎藥和9-順式-視黃酸激活；PPARβ/δ被不飽和脂肪酸和9-順式-視黃酸激活；PPARγ被不飽和脂肪酸、類十二烷酸、噻唑烷衍生物、非甾體抗炎藥和9-順式-視黃酸激活；3種亞型被激活后通過識別特異的核苷酸序列并與之結合來啟動和調控線粒體解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1, UCP 1)的表達。UCP 1是來自小鼠棕色脂肪的線粒體解偶聯蛋白，UCP 1是唯一在褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)中表達的解偶聯蛋白質，有別于解偶聯蛋白家族其他成員的功能，UCP 1的主要功能是參與BAT的產熱調節和能量代謝來維持機體的能量代謝平衡[30]。目前有研究指出UCP 1基因啟動子核苷酸片段形成的G-四鏈體構型調節其表達，具有誘導白色脂肪棕色化的潛力，在肥胖的防治中有一定的應用開發價值[31]。

3 結論

本論文對牦牛酥油中MFGM蛋白FABP 3的分離純化工藝進行優化，得出最優條件：洗脫體積50 mL，緩沖液pH 7.4，洗脫速度1.6 mL/min，洗脫液濃度0.50 mol/L，該條件下FABP 3的得率達83.19%。

采用SDS-PAGE和液質聯用對純化前后酥油MFGM鑒定，共鑒定到31種MFGM蛋白和20種差異蛋白。GO分析結果表明，在生物過程方面，這些蛋白質參與生物調節、刺激反應、多細胞組織化過程、代謝過程等；細胞成分方面，在細胞、細胞解剖學實體、細胞內等5類細胞組分內高度富集；在分子功能方面，主要參與結合作用、催化反應、分子功能調節器、轉運等等。

通過KEGG代謝通路分析可知，牦牛酥油MFGM蛋白純化前后差異蛋白共參與15條KEGG代謝通路，其中有3種蛋白參與了內質網中蛋白質加工相關的KEGG通路，進而調控內質網蛋白質的加工；FABP 3參與了PPAR信號通路，推測可能參與其中與脂肪酸降解、膽汁酸合成、甘油磷脂代謝相關的類脂物代謝作用，為進一步探究牦牛酥油FABP 3的作用位置和參與途徑提供參考。