響應面法優化超聲波-微波協同輔助酸法提取獼猴桃皮果膠工藝及果膠理化性質分析

陳怡君，王曉慧，陳艷萍，鄧敏，伊帕爾·開斯爾，龍元愛，楊萬根, *

1(吉首大學 林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界，427000)2(吉首大學 食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點實驗室，湖南 吉首，416000)3(湖南省周生堂生物科技有限公司，湖南 鳳凰，416200)

獼猴桃富含維生素C等營養成分，我國獼猴桃產量居世界第一[1]。隨著我國食品加工業的發展，獼猴桃加工產品如果汁、果酒、果醬和果脯等的產量持續增長，但由此產生的獼猴桃皮渣(原料的20%～30%)卻未能得到充分利用，不僅造成資源浪費，而且也存在污染環境的風險，成為了亟需解決的難題。

果膠是廣泛存在于植物初生細胞壁和細胞內層的一類復雜天然高分子聚合物，根據酯化程度的不同，可分為高酯果膠和低酯果膠。果膠在食品中用途廣泛，可作食品加工中的膠凝劑、增稠劑、膠體穩定劑和脂肪替代品等。果膠還具有降血脂、降膽固醇、抑制脂肪酶活性等生理活性，可用于藥品的合成。隨著對果膠在食品及醫藥行業的研究不斷深入，世界需求量以每年5%的速度增長[2]，而我國果膠的產量不足，年需求缺口達1 200 t，且呈上漲趨勢[3]，因此果膠資源的開發迫在眉睫。目前，商業果膠大多來源于柑橘皮和蘋果渣。近年來其他植物來源果膠也受到關注，如柿子、檸檬皮、葵花籽等。獼猴桃皮渣果膠同樣是果膠的良好來源，如苗壯等[4]以獼猴桃皮渣為原料，采用亞臨界法提取果膠，果膠得率為11.4%；蔣治衛等[5]以紅心獼猴桃果皮為原料，采用草酸銨法提取果膠，得率為13.0%。但是這些報道均集中于單一輔助提取技術研究，果膠得率不高。

傳統的果膠提取采用熱水提取法，該法耗時長、能耗高且效率低。近年出現超聲波輔助提取技術，其利用強烈的空化效應快速破壞植物細胞，能縮短提取時間，提高提取效率，但其熱效應不強，提取過程很難達到足夠的提取溫度。超聲波-微波協同作用是將超聲波的機械振蕩和空化效應與微波的熱效應結合，使反應過程中整個體系受熱均勻，加速分子運動，促使分子間氫鍵更容易斷裂，并能破壞大分子物質的共價鍵而促其降解，同時提高溶劑穿透力，加速提取的進程，其提取效率比單獨用超聲波或微波更高。另外，與傳統酸法提取相比，超聲波-微波輔助提取所得果膠中的蛋白質含量低，而半乳糖醛酸含量高，設備損耗成本低[6]。

目前，采用超聲波-微波協同輔助酸法提取獼猴桃皮果膠的研究還未見報道。本研究以果膠得率為指標，利用超聲波-微波協同輔助酸法提取獼猴桃皮中的果膠，在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman試驗及Box-Behnken響應面試驗優化工藝參數以提高果膠得率，并對所得果膠的理化性質進行分析，為獼猴桃皮渣資源的高值化利用提供技術和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃皮，湖南周生堂生物科技有限公司；檸檬酸、苯酚、濃硫酸、酚酞、NaOH、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；D-半乳糖醛酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、咔唑等，北京索萊寶科技有限公司；三氟乙酸、NaCl，比利時Acros公司；甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-果糖、D-核糖、氨基半乳糖鹽酸鹽、L-古洛糖醛酸、D-甘露糖醛酸，Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

PHSJ-4A型pH計，上海雷磁精科有限公司；TG165型臺式高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；JA2003型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；XH-300PE型超聲波高壓微波協同組合工作站，北京祥鵠科技發展有限公司；TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司；UV-2500型紫外分光光度儀、LC-10A型高效液相色譜儀，日本島津有限公司；JSM-6700F型掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司；ICS5000型離子色譜儀(IC)，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃皮渣粉制備方法

獼猴桃皮渣在沸水中漂燙5 min，使其中的果膠酶失活。在45 ℃烘箱中烘24 h，干燥后的皮渣粉碎后過80目篩，裝入塑封袋，4 ℃下保存，備用。

1.3.2 獼猴桃皮渣果膠提取工藝

1.3.2.1 超聲波-微波協同輔助酸法提取法

稱取3.0 g獼猴桃皮渣粉，以不同pH的檸檬酸溶液為提取溶劑，按照設定參數在超聲波高壓微波協同組合工作站中提取果膠。提取完成后，提取液迅速冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，抽濾上清液，收集濾液，加入2倍體積95%乙醇，4 ℃靜置16 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀物用95%乙醇洗滌3次，去除單糖、雙糖、低聚糖和色素等物質[7]。最后，將沉淀凍干至恒重，所得樣品為獼猴桃皮果膠，果膠得率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m，果膠干燥品質量，g；m0，獼猴桃皮干粉質量，g。

1.3.2.2 傳統熱水提取法

按照NGUYEN等[8]的方法提取。取3.0 g獼猴桃皮渣粉，加入90 mL pH 2.0的檸檬酸溶液，85 ℃下連續攪拌提取30 min。提取完成的后續操作同1.3.2.1。

1.3.3 單因素試驗

設定單因素試驗中的常規量為：提取液pH 2.0，超聲波功率150 W，微波功率250 W，提取時間30 min，提取溫度85 ℃，液料比30∶1(mL∶g)。依次考察微波功率(50、100、150、200、250、300 W)、超聲波功率(50、100、150、200、250、300 W)、液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1)、提取液pH(1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6)、提取時間(20、25、30、35、40、45 min)、提取溫度(45、55、65、75、85、95 ℃)對果膠得率的影響。

1.3.4 Plackett-Burman 試驗

根據單因素試驗結果，設計N=12的Plackett-Burman試驗對提取液pH、液料比、超聲功率、微波功率、提取溫度和提取時間等因素進行考查，篩選關鍵因素。

1.3.5 響應面優化試驗

根據Plackett-Burman試驗結果，對篩選出的關鍵因素進行Box-Behnken試驗。

1.3.6 果膠半乳糖醛酸含量測定方法

采用咔唑比色法測定獼猴桃皮渣果膠中半乳糖醛酸含量[9]。

1.3.7 果膠總糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法測定獼猴桃皮渣果膠中總糖含量[10]。

1.3.8 果膠酯化度測定方法

采用滴定法測定果膠酯化度[11]。

1.3.9 果膠蛋白質含量測定方法

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[12]。

1.3.10 果膠分子質量測定方法

采用高效凝膠滲透色譜法測定果膠分子質量。色譜檢測條件：RI-10A示差檢測器；BRT105-104-102串聯凝膠色譜柱(8 mm×300 mm)；流動相0.05 mol/L NaCl溶液；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。果膠樣品配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微濾膜過濾后進樣。

1.3.11 果膠單糖組成測定方法

稱量10.0 mg樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L三氯乙酸10 mL，120 ℃水解3 h。吸取2 mL酸水解溶液轉移至玻璃瓶中氮吹干，加入10 mL超純水渦旋混勻，吸取100 μL加入900 μL去離子水，12 000 r/min離心5 min。取上清液進IC分析。色譜條件：色譜柱DionexCarbopacTMPA20(3 mm×150 mm)；流動相A：H2O， B：15 mmol/L NaOH，C：15 mmol/L NaOH+100 mmol/L NaOAc；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測器：電化學檢測器。

1.3.12 光譜分析

配制10 μg/mL的果膠溶液，取適量溶液于石英比色皿中，用紫外分光光度計進行掃描，掃描波長為200～400 nm，掃描頻率為2 nm/s，得紫外光譜。

稱量1.0 mg獼猴桃皮果膠樣品和100.0 mg溴化鉀，置于瑪瑙研缽中混勻，研磨成細粉后制成透明壓片，用傅里葉紅外光譜儀進行掃描，掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，累積掃描64次，得紅外光譜。

1.3.13 電鏡掃描

果膠樣品經過粘臺、噴金等步驟后，在加速電壓為10 kV條件下用掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.4 數據處理方法

試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。用Design-Expert 8.0.6 軟件分析響應面試驗結果，SPSS Statistics 22.0軟件開展ANOVA多重比較(least significant difference，LSD)，顯著性水平為0.05，Origin 2019b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

如圖1顯示，隨微波功率增大，果膠得率先升高后降低，在微波功率200 W時，達到最大值28.63%。這是因為當微波功率較小時，熱效應較弱，導致原料內部的溫度過低，不利于果膠的溶出和擴散。當微波功率過大時，導致細胞內部溫度過高，使果膠分子鏈降解，從而使果膠得率下降[13]。在微波功率150 與200 W及200 與400 W之間，果膠得率差異顯著(P<0.05)，在其他水平之間，差異不顯著(P>0.05)。

a-微波功率；b-超聲波功率；c-液料比；d-提取液pH；e-提取時間；f-提取溫度圖1 不同因素對果膠得率的影響Fig.1 The effects of different factors on the yield of pectin

隨超聲功率增大，果膠得率先升高后降低，在超聲功率為250 W時，達到最大值29.08%。這是由于超聲波功率增大，空化作用增強，使細胞內容物更加充分析出，但超聲波功率過大，導致果膠因分子鏈斷裂而降解[14]。在超聲波功率50 與150、200、250 及200、250 與300 W之間，果膠得率差異顯著(P<0.05)，在其他水平之間，差異不顯著(P>0.05)。

隨液料比提高，果膠得率先升高后降低，之后基本無變化。在液料比為30∶1時，達到最大值31.48%。這是因為溶劑量少時，提取液黏度較大且濃度梯度小，果膠分子擴散慢；而溶劑量過大時，提取出的果膠在溶液中濃度太低，沉淀效果不理想，導致果膠得率降低[15]。在液料比20∶1、30∶1之間及它們與其他水平之間，果膠得率差異顯著(P<0.05)，在其他水平之間，差異不顯著(P>0.05)。

隨提取液pH升高，果膠得率降低，pH 1.6時果膠得率達到最大，為31.60%。這是由于酸度增強有利于原果膠的水解，使更多的原果膠轉化為水溶性果膠，因此提高了果膠的得率[16]。pH升高時由于酸性減小，斷裂的a-1, 4-糖苷鍵較少，一部分果膠分子較大，不易溶解于水中，所以pH升高時果膠的得率下降[16]。在pH 2.8與3.2之間果膠得率差異不顯著(P>0.05)，其他水平之間均差異顯著(P<0.05)。

隨提取時間延長，果膠得率先升高后降低，在提取時間為35 min時達到最大值33.93%。這是由于提取體系中積累的熱量逐漸增加，為原果膠的水解提供了更多的能量，原果膠中化學鍵斷裂，溶解于水中[17]，因此果膠的得率增加。隨著提取時間進一步延長，由于果膠大分子結構被過度破壞，使提取液中的果膠不能在乙醇溶液中析出，部分果膠被過濾掉，使果膠得率降低[18]。在提取時間40與45 min之間果膠得率差異不顯著(P>0.05)，其他水平之間均差異顯著(P<0.05)。

隨提取溫度升高，果膠得率增大，當提取溫度上升至95 ℃時，果膠得率達到最大值34.00%。當浸提溫度低時，原果膠水解不徹底，不利于水溶性果膠的提取。溫度升高后，分子熱運動加劇，同時檸檬酸的解離程度也增強，氫離子濃度增加，細胞壁和表皮組織更加松弛，使得提取液與原料間的物質交換加快，而果膠不會在此溫度范圍內降解，因此得率增大[19]。在提取溫度65與75 ℃之間果膠得率差異不顯著(P>0.05)，其他水平之間均差異顯著(P<0.05)。

2.2 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗結果見表1，其方差分析結果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗結果Table 1 The results of the Plackett-Burman experiment

表2 Plackett-Burman試驗各因素效應評價Table 2 The effect evaluation of the factors of Plackett-Burman experiment

由表2可知，提取液pH、提取溫度、微波功率對果膠得率的影響均達到顯著水平(P<0.05)，根據P值大小，可知重要性依次為：提取溫度(b)>提取液pH(a)>微波功率(f)。故選擇提取液pH、提取溫度和微波功率開展下一步的響應面優化試驗。考慮到提取效率與節約成本，在響應面優化試驗中將液料比、超聲功率、提取時間分別固定為30∶1，250 W、35 min。

2.3 Box-Behnken響應面試驗結果

表3 Box-Behnken響應面試驗結果Table 3 The results of the Box-Behnken experiment

表4 回歸模型方差分析結果Table 4 The results of variance analysis of response surface quadratic model

運用 Design-Expert 8.0.6 軟件由模型分析得出，超聲波-微波協同輔助酸法提取獼猴桃皮果膠的最優工藝參數為：提取液pH 1.73，提取溫度91.17 ℃，微波功率214.35 W。此條件下的果膠得率理論值可達35.23%。為了在實際中具有可操作性，將最優工藝參數確定為：提取液pH 1.7、提取溫度91 ℃、微波功率215 W。根據修正后的最優工藝進行3次驗證試驗，果膠得率為34.88%，與預測值十分接近，表明響應面法優化提取工藝可行。參照NGUYEN等[8]的傳統熱水提取法，得到獼猴桃皮果膠提取率為6.87%，該值遠低于本研究所采用超聲波-微波協同輔助酸法提取工藝的果膠得率。

各因素之間的交互作用對響應值的影響見圖2。響應面曲面坡度越陡峭，等高線圖越偏橢圓形，因素之間交互作用越顯著，反之則表示兩因素間的交互作用不顯著。圖2顯示，3D響應面圖均成拋物狀，曲面有最高點，容易出現最大值。AB的響應面曲線最陡，且等高線密集，因此AB的交互作用對果膠得率的影響最為顯著。交互作用對果膠得率的影響大小順序為：AB>BC>AC。

圖2 兩因素間交互作用響應面圖Fig.2 The response surface plots of interaction between two factors

2.4 果膠的基本化學組成及酯化度

如表5所示，果膠的主要化學成分為半乳糖醛酸，其含量可以反映果膠的純度，經測定，獼猴桃皮渣果膠的半乳糖醛酸含量為67.85%，符合GB 25533—2010《食品添加劑果膠》要求(半乳糖醛酸含量>65%)，說明本實驗果膠已達到商品果膠純度的要求。總糖含量為60.83%，蛋白質含量為1.78%,酯化度為54.5%，為高酯果膠。

表5 獼猴桃皮渣果膠基本化學組成及酯化度 單位：%Table 5 The basic chemical composition and the degree of esterification of pectin from kiwifruit peel

2.5 分子質量測定

圖3顯示，獼猴桃皮果膠多糖的主要洗脫峰單一且較對稱，說明果膠純度較高，通過線性回歸方程計算，其重均分子質量Mw為741.8 kDa，數均分子質量Mn為410.3 kDa，峰值分子質量Mp為503.8 kDa，分子量分布系數Mw/Mn為 1.81。苗壯等[4]用亞臨界水提取法從獼猴桃皮與果渣中得到的果膠分子質量Mw為88.4 kDa。顧曉俊等[20]測定獼猴桃果的果膠分子質量Mw最高為524.31 kDa。與兩者相比，本研究得到的果膠分子質量較大，可能是果膠來源部位不同所致。

圖3 獼猴桃皮渣果膠分子質量色譜圖Fig.3 The chromatogram of molecular weight of pectin from kiwifruit peel

2.6 單糖組成測定

圖4顯示，獼猴桃皮渣果膠中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸等5種單糖。各單糖摩爾百分含量為：鼠李糖4.2%，阿拉伯糖18.2%，半乳糖13.6%，葡萄糖5.5%，半乳糖醛酸58.5%。與苗壯等[4]采用亞臨界水提取獼猴桃皮渣中果膠相比，本研究果膠的單糖種類基本相同，但前者阿拉伯糖所占比例較高。

1-巖藻糖；2-鹽酸氨基半乳糖；3-鼠李糖；4-阿拉伯糖；5-鹽酸氨基葡萄糖；6-半乳糖；7-葡萄糖；8-N-乙酰-D氨基葡萄糖；9-木糖；10-甘露糖；11-果糖；12-核糖；13-半乳糖醛酸；14-古羅糖醛酸；15-葡萄糖醛酸；16-甘露糖醛酸a-16種單糖混合標準品；b-果膠水解物單糖組成圖4 獼猴桃皮渣果膠的單糖組成色譜圖Fig.4 The chromatogram of monosaccharide composition of pectin from kiwifruit peel

根據分子主鏈和支鏈結構的不同，果膠分子可分為4類：同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(rhamngalacturonan Ⅰ，RG-Ⅰ)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(rhamngalacturonan Ⅱ，RG-Ⅱ)和木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan，XG)[21]。SCHOLS等[22]曾提出，當果膠分子的Rha/GalA值在0.05～1.00時，其結構主要為RG-Ⅰ型；當比值低于0.05時，結構主要為HG和RG-Ⅱ型。此果膠Rha/GalA的比值為0.072，因此可推斷本研究所得獼猴桃皮果膠多糖以RG-Ⅰ型結構域為主。馬媛媛[23]研究3種不同品種的獼猴桃果實的果膠組分，發現其Rha/GalA值范圍在0.002～0.04，結構以HG和RG-Ⅱ型為主。說明獼猴桃果實與皮的果膠結構存在差異。FERREIRA等[24]提出，根據(Gal+Ara)/Rha值可估計RG-I型果膠分子結構的側鏈長度，其值越大，表明通過鼠李糖連接到RG-I主鏈上的側鏈越長。本研究所得獼猴桃皮果膠的(Gal+Ara)/Rha為7.51，而馬媛媛[23]研究中的(Gal+Ara)/Rha值在7.07～14.17，因此推斷獼猴桃皮果膠中通過鼠李糖連接到RG-I主鏈上的側鏈較果實果膠的短。

2.7 果膠光譜分析

2.7.1 紫外光譜

圖5為獼猴桃皮渣果膠溶液在200～400 nm紫外波長范圍的吸收曲線。可看出，果膠溶液在280 nm處有吸收峰，215、260 nm處無吸收峰，表明果膠樣品含有少量蛋白質，但不含核酸、多肽。

圖5 獼猴桃皮渣果膠紫外光譜Fig.5 The UV spectra of pectin from kiwifruit peel

2.7.2 傅里葉紅外光譜特征

圖6 獼猴桃皮渣果膠的傅里葉紅外光譜圖Fig.6 The FT-IR spectroscopy of pectin from kiwifruit peel

2.8 果膠電鏡掃描觀察結果

如圖7所示，放大1 000倍條件下，果膠表面呈現凹凸不平形貌特征，并且表面有大小均一的顆粒狀微球存在，故果膠在乙醇溶液中可能是以微球顆粒的形態沉淀出來。當放大10 000倍時，可以更加明顯看出果膠表面結構致密，由大量顆粒狀微球組成，且微球直徑約為0.2 μm。

a-×1 000；b-×10 000圖7 獼猴桃皮渣果膠的電子掃描顯微圖像Fig.7 The scanning electron microscopy images of pectin from kiwifruit peel

3 結論

本文優化了超聲波-微波輔助酸法提取獼猴桃皮渣中果膠的工藝參數，并分析所得果膠樣品的理化性質。優化得到的工藝參數為：提取液pH 1.7、提取溫度91 ℃、微波功率215 W、超聲波功率250 W、提取時間35 min、液料比30∶1。在此工藝條件下，果膠得率實際值為34.88%。相比其他方法，超聲波-微波輔助酸法提取的果膠得率有顯著的提升。所得果膠的總糖含量為60.83%，蛋白質含量為1.78%，酯化度為54.53%，半乳糖醛酸含量為67.85%，重均分子質量(Mw)為741.78 kDa，單糖組成及其摩爾百分比為鼠李糖4.2%、阿拉伯糖18.2%、半乳糖13.6%、葡萄糖5.5%、半乳糖醛酸58.5%。獼猴桃皮渣果膠分子以RG-I結構域為主。電鏡掃描顯示果膠表面粗糙，由結構緊致的微球顆粒構成。紫外與紅外光譜分析顯示，獼猴桃皮渣果膠符合果膠特征。本研究所采用的技術節能、高效，對環境友好，研究結果可為獼猴桃皮渣資源的高值化利用提供技術和理論支撐。本研究尚需進一步開展果膠的乳化、膠凝等功能特性及應用研究。