色譜技術在肽分離中的應用

張碩，陳炬龍，唐雨欣，蔡寶國

(上海應用技術大學 香料香精化妝品學部，上海，201418)

伴隨食品、醫藥和生物等科學與工程技術的不斷交叉發展，肽的應用范圍不斷擴大。隨之肽的需求呈現快速增長的趨勢，這對于肽的分離和純化工作提出了更高的要求。對肽進行精確且系統的分離是獲取優質肽、提高其性能及擴大其應用的重要前提。肽存在結構和性質多樣性的特點，肽分離的儀器也隨之更新迭代，以適應實際分離需要。色譜分離為肽分離和制備提供了良好的技術支持，常用的色譜技術有：離子交換色譜、分子排阻色譜和反相高效液相色譜。目前，對色譜技術在肽分離中的應用進行綜合和系統的評述較少。本文將闡述3種色譜技術的原理及其在肽分離中的應用，為肽分離工作提供合理的理論指導和技術支持，以進一步擴大肽在食品、醫療和化妝品中的應用。

1 肽的簡述

肽是一類介于氨基酸和大分子蛋白質之間的線性聚合體。因其具有分子質量低、易于吸收、生物活性高和免疫原性低等特性，逐漸成為食品[1-2]、醫藥治療[3-4]、美容[5-6]和化妝品[7-8]領域的重點研究對象。肽的生物活性和功能取決于它們的氨基酸組成、序列和分子質量[9]。人體內的多種自然生理活動都與特定肽的相互作用產生的信號傳遞和調節有關[10]。一般而言，按照氨基酸的組成和數量的不同，分為2～10個氨基酸的寡肽、10～50個氨基酸的多肽和50個以上氨基酸組成的蛋白質。功能肽的分子質量普遍在300～1 200 Da，以平均每個氨基酸120 Da的分子質量計算，相當于肽數目在3～10個。當肽的分子質量小于10 000 Da，易于滲透組織，被人體吸收的效果較好[11]。與此同時，在市場銷售的化妝品用肽原料同樣也是普遍在十肽及以下，如六肽-1、五肽-3和三肽-2等。

肽具有獨特的帶電性、親疏水性、不同的分子質量，以及可形成不同構型的特點[12]，為色譜對其進行分離分析提供了理論基礎。例如，肽根據本身含有的某些氨基酸特定結構如苯環結構可以產生一定的光學性質(紫外吸收和熒光吸收)，如α-氨基酸可以發生茚三酮反應、Sanger反應和Edman降解等，如酰胺鍵可以發生雙縮脲。根據R基的電荷性和極性，多肽可以表現出酸性、堿性和中性，強水溶性和弱水溶性等。

常見肽以獲取來源可以分為天然提取肽、生物合成和人工化學合成肽[13]。其中，天然提取肽，通常是從海洋、可食用植物中提取，動物提取較少。其受到提取材料的地理和環境的影響，操作工藝較為復雜，產量較低，成本高。生物合成肽，適合制備大于50個氨基酸組成的目的多肽，較易獲得，且隨基因重組技術發展，推動了該技術的快速發展。人工合成肽，主要是通過化學合成的方法來制備多肽，產量高且成本低[11]，但由于合成過程副產物多，且環境不友好，因而受到限制。

2015年多肽類藥物在全球銷售額達到220億美元，目前約有80種肽類藥物被批準銷售上市，處于開發研究和臨床試驗階段的還有上百種。據透明度市場研究(Transparency Market Research)調查報告《Protein Hydrolysates Market》顯示，肽作為蛋白質水解產物的重要功能性成分之一，越來越多地被用于食品、臨床營養、化妝品和個人護理等領域[14]。據全球領先數據提供機構市場觀察(MarketWatch)報道，2021年口服肽復合年增長率為6.6%，到2026年預計將達到11.394億美元[15]。肽具有食品營養和呈味、疾病治療、美容抗衰老等功能，在食品、醫療和美容化妝品等領域應用廣泛。在食品領域，來自天然生物質資源的蛋白質水解物和肽可根據其生物活性被用作功能性食品，例如一些從海洋提取的具有抗氧化作用生物活性肽，從植物獲得的抗菌肽等，抗菌肽AMPs在食品保存中能起到抑菌作用達到抑制脂質氧化[16]。在醫療方面，肽療法在醫療實踐中發揮了顯著的作用，宿主防御肽(host defense peptide,HDP)表現出廣泛的抗菌和免疫調節活性[17]，ACE-抑制肽具有抗血壓、降血脂的功能[18]。另外，有些肽經研究發現具有抗抑郁作用[19]。在美容化妝品領域，肽不僅可以治療面部老化，還可以治療痤瘡和改善皮膚的先天免疫系統，以及緊致皮膚和淡化色斑[10]。因此，隨著肽的種類和數量需求的快速增加，對于肽的分離技術提出了更高的要求。

2 色譜技術原理及其應用

2.1 離子交換色譜

2.1.1 離子交換色譜的原理及其特點

離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)是分離帶電肽的一類重要的色譜技術。在一定pH下，待分離的肽和流動相，與固定相上的離子交換劑基團進行可逆的相互作用，因作用力強弱不同與離子交換劑基團相互競爭吸附。陰離子交換劑優先對作用力強的負電荷含量高的肽進行靜電吸附，而含正電荷的肽被洗脫下來[20]，最后通過高鹽濃度梯度或pH梯度洗脫液將待分離肽洗脫下來從而達到分離目的。洗脫過程中，與離子交換劑結合作用弱的先被洗脫下來，而結合作用強的被后洗脫下來[21](圖1)。

圖1 離子交換色譜原理Fig.1 Principle of ion exchange chromatography

“離子電荷性質”是離子交換色譜分離肽溶液的核心。有學者指出離子交換色譜在親水性化合物的分析和純化中發揮了重要作用[22]。肽溶質與離子交換劑的交換結合力，主要取決于它們的物理化學性質和等電點呈現的離子狀態，例如環境pH高于等電點時，肽帶負電荷與陰離子交換劑結合，相反則與陽離子交換劑結合。HENNEMAN等[23]在探究分離多肽及其混合物中指出根據肽或蛋白質的理化性質在已知pH的電荷下可以采用離子交換色譜進行分離。同時，環境pH與等電點的差值越大，肽與離子交換劑的結合力越強。被分離的肽的電荷密度和等電點值與色譜柱上的離子交換劑的離子容量大小決定保留能力的強弱。離子交換色譜最為明顯的優勢在于它的分離條件最接近生物的生理環境，利于溫和條件下的可逆洗脫操作且不易導致肽變性，對生物分子有一定的兼容性。但是，由于其定性能力較差，需要聯合其他多種分離技術進行操作，而且該色譜較昂貴，結構復雜，不太適合分離對pH和金屬離子敏感的生物分子。

2.1.2 離子交換色譜在肽分離中的應用

離子交換色譜分離肽和小分子蛋白質的應用步驟主要包括：(1)根據預分離的肽性質選擇適合的離子交換色譜；(2)肽溶液先在緩沖溶液預平衡；(3)以含有不同濃度NaCl的緩沖溶液以特定流速和檢測波長進行洗脫。

如表1所示，瓊脂糖凝膠和纖維素是最為常見的2種載體。一般陰離子鍵合固定相基團有二乙胺基乙基(diethyllaminoethyl，DEAE)和三甲胺基烷基季銨基(trimethylamino alkyl quaternary ammonium group，Q)等，陽離子鍵合固定相基團有磺丙基(sulfopropyl，SP)和羧甲基(carboxymethyl，CM)等。它們可以被鍵合于交聯葡聚糖(sephadex)、纖維素(cellulose)等一些載體上。例如， DEAE鍵合于高流速瓊脂糖凝膠能夠形成一種弱堿性環境的陰離子交換介質，即陰離子交換色譜。有學者在研究芳族基團與多峰和常規離子交換樹脂的相互作用機理中，指出芳香族部分可與多峰和常規離子交換樹脂發生相互作用，陽離子(例如Na+)有助于減弱芳香族部分與配體的結合[21]。同時，由于液相色譜中存在的金屬離子對于具有負電荷的多肽在陰離子交換色譜中的影響，有學者利用螯合劑進行處理[24]，結果分離效果得到了有效的改善。因此，采用離子交換色譜分離肽溶質時需要考慮待分離溶液中是否有干擾離子及其濃度或含量。

表1 離子交換色譜柱在肽分離中的應用Table 1 Application of ion exchange chromatography in the isolation of peptide

續表1

一般而言，采用離子交換色譜分離肽時，常需用到Tris-HCl、HAc-NaAc、PBS和二乙醇胺等緩沖溶液進行預先平衡，緩沖液作用使得待分離的肽溶質帶上一定的電荷并營造pH環境，使其與離子交換劑可以充分地結合。

洗脫方式常見有3種：第一種是改變緩沖液pH，從而改變肽的吸附狀態為解吸附狀態。例如，在陽離子交換色譜中，提高流動相pH使吸附在柱子上的帶正電荷的肽帶負電，從而達到解吸附；第二種是增加緩沖液的離子強度，將吸附強的分子從離子交換劑上替換下來，例如梯度不斷增加的NaCl溶液；第三種即將前兩者相互結合從而達到洗脫目的。已報道的文獻中，常以NaCl進行洗脫居多，濃度范圍在0～1.0 mol/L,流速一般控制在0.8～2.0 mL/min。需要注意的是，流速如果過快，電荷吸附作用差異不明顯的肽溶質難以明顯分離；但是流速過慢會消耗時間，降低分離效率。

肽的檢測波長一般多在214～280 nm，常見的有214、220和280 nm，前兩者是因為酰胺鍵的吸收波長與之接近，280 nm是用于檢測含有苯環結構氨基酸，如L-色氨酸(Trp, W)和L-酪氨酸(Tyr, Y)，這些氨基酸連接而成分子質量較高的肽。在具體的分離過程中，可以先掃描待測液的最大吸收波長，而后確定其檢測波長。

由于離子交換色譜分離的依據主要是不同肽段所帶電荷的不同，經先后分離不同電性肽段從而篩選和獲取目標肽段。以常見的有降壓作用的ACE-I抑制肽分離為例，大部分以DEAE作為陰離子固定相基團。NOORANI等[25]從沿海廢棄的棘突猛蝦蛄殘肉中分離ACE-I抑制肽，分離過程中使用了DEAE 纖維素的離子交換色譜柱。將經過凍干獲取的粗樣品溶解于醋酸鈉緩沖溶液，用1.0 mol/L NaCl為變化梯度以2.0 mL/min的流速進行洗脫，成功獲得了3 000 Da的AC肽段和3 000～10 000 Da的TH肽段，經過后續的分離得到351 Da的MSN和388 Da的MTH兩個肽段。而從植物提取的ACE抑制肽中，ZHANG等[26]從醋泡黑豆蛋白水解產物中提取ACE抑制肽，使用了DEAE瓊脂糖凝膠的離子交換色譜柱，先用pH 8的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡后，用含0、0.05、0.1和0.2 mol/L NaCl的緩沖液以1.8 mL/min的流速逐步洗脫樣品，最終分離出了IILLSF、SIKFGSF和RSPEDSIIF等3個肽段。CHEN等[27]從薏苡仁中也采用該類離子交換色譜柱，先用pH 8.8的二乙醇胺緩沖液平衡薏苡仁醇溶蛋白后，用0～0.5 mol/L的NaCl以2.0 mL/min流速進行洗脫，獲得分子質量小于3 kDa的肽段。

2.2 分子排阻色譜

2.2.1 分子排阻色譜的原理及其特點

分子排阻色譜(size exclusion chromatography，SEC)，亦稱之為凝膠過濾層析，是一類分離不同分子質量肽的重要色譜技術，其分離原理類似于過濾，是基于具有網狀結構的凝膠顆粒發揮分子篩作用，在流動相的帶動下篩選并過濾出分子質量不同的肽，分子質量越小的肽越能夠進入凝膠的內部孔徑中而導致留出時間越慢，而無法進入凝膠顆粒的大分子則可直接穿過凝膠顆粒的顆粒間隙流出(圖2)。

圖2 體積排阻色譜原理Fig.2 Principle of size exclusion chromatography

與離子交換色譜不同的是，分子排阻色譜中待分離的肽不會跟色譜基質發生作用，適合分離對pH和金屬離子敏感的生物分子，具有高選擇性和高分辨率[6]。不足之處在于樣品的檢測收集消耗時間，分辨率會受到凝膠孔徑和粒徑的大小和均勻度的影響。

2.2.2 分子排阻色譜在肽分離中的應用

分子排阻色譜在肽的初步分離中發揮了重要作用。文獻調查發現，交聯葡聚糖凝膠(Sephadex)是分離肽最常見的分子排阻色譜填料，最為普遍使用的是Sephadex G-15 和 Sephadex G-25，分離的肽分子質量普遍在200～1 300 Da。在G-X中，X代表交聯葡聚糖凝膠吸水值的10倍。即G-15為每克交聯葡聚糖凝膠膨脹時能吸取1.5 g水，因此數值越大，其吸水膨脹越明顯，分子交聯程度越復雜，孔徑越小，小分子肽越難以透過。分子排阻色譜的色譜柱長度、流動相和流速與離子交換色譜柱不一樣。其中，分子排阻色譜的色譜柱長度一般是離子交換色譜柱的5～10倍。為了使得交聯葡聚糖凝膠可以充分分離肽溶質，一般的流速控制在0.2～1.0 mL/min。同時，分離過程不需要和離子交換色譜柱一樣附帶高濃度離子進行洗脫，一般采用含有少量可以溶解肽的鹽酸的超純水或者緩沖溶液。分子排阻色譜在肽分離中的應用具體實例見表2。

表2 分子排阻色譜在肽分離中的應用Table 2 Application of size exclusion chromatography in the isolation of peptide

一般而言，使用分子排阻色譜洗脫肽的步驟主要包括：填料溶脹、裝柱排氣、上樣、洗脫和收集餾分。先將交聯葡聚糖凝膠干粉在超純水或緩沖溶液中浸泡4～5 h使其充分溶脹，多次洗滌和除氣。分子排阻色譜柱使用前需要洗滌干凈，垂直地固定在鐵架臺上。先將超純水或緩沖溶液加入分子排阻色譜柱，適當調節恒流泵的流速將柱內的氣泡排除。將超純水或緩沖溶液液面降低至距離下端出水口1.0～2.0 cm時關閉恒流泵。將溶脹好混勻的交聯葡聚糖凝膠緩慢加入分子排阻色譜柱，待其自然沉降后，再加入超純水或緩沖溶液洗脫平衡1～2個柱床體積，直到緊密和均勻的凝膠色譜柱形成。接著，緩慢地加入不超過柱床體積10%的肽溶液，開啟恒流泵，待其洗脫至液面與凝膠色譜柱頂端液面齊平時，關閉恒流泵再加入緩沖溶液，再開啟恒流泵繼續洗脫。在洗脫過程中，收集餾分。

由于分子排阻色譜主要以分子質量大小作為分離依據，因此肽的離子性和極性對其分離過程影響不大。以樹桑葉蛋白水解物為例，分子排阻色譜柱的柱長選擇90 cm，流速控制在0.5 mL/min，抗氧化肽組分F5在Sephadex G-15色譜柱中經去離子水洗脫后分離出69.74%的450～1 400 Da的肽段和22.56%的300～450 Da小分子肽段[32]。而同樣采用Sephadex G-15色譜柱分離苦蕎麥水解物肽分子的流速控制在0.8 mL/min，當其收集體積在20～30 mL時，·OH清除率最高的肽片段的分子質量在550～750 Da[34]。這兩者都是植物提取的抗氧化肽，在Sephadex G-15色譜柱中均分離出了分子質量在500～800 Da的肽段。而利用Sephadex G-10色譜柱分離由離子交換色譜初分離獲得的薏苡仁抗高血壓肽餾分C，結果顯示該組分雖然分離出了C1和C2兩個主要餾分[27]，但其分離度并不明顯，雖然該文獻中并未顯示出具體的柱長和流速，但是這種情況下可以嘗試增長柱長，減小流速以提高分離度。對于Sephadex G-25柱，牛-α乳白蛋白[35]和橙籽蛋白水解物[36]分離的降血糖肽段分子質量在900～1 300 Da。這也進一步應證了分子排阻色譜填料吸水值及其膨脹交聯度跟分離的肽段分子質量存在緊密聯系。一般而言，隨著G-X的X數值增大，分子交聯程度越緊密，小分子肽得以分離，大分子肽分離純度更高。

2.3 反相高效液相色譜

2.3.1 反相高效液相色譜的原理及其特點

反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式，基于樣品中不同組分和分離基質疏水基團間疏水作用的強弱不同而進行分離，因具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快等優點，被廣泛應用于肽的分離[40]。其工作原理是色譜柱內部填充的是表面經過酸化處理含有烷基(或苯環)的非極性微硅膠載體，流動相先在微硅膠表面形成一層溶劑膜，隨著肽溶質分子的進入，肽的非極性基團與烷基(或苯環)作用而占據部分溶劑膜空間，而形成吸附的單分子吸附層。由于這種吸附是具有可逆性的，當流動相的極性發生變化時如非極性增強，肽溶質分子會發生解吸附而被洗脫下來。因此，流動相在由強極性流動相變為低極性流動相時，強到低極性肽溶質分子會先后被洗脫下來(圖3)。

圖3 反相高效液相色譜原理Fig.3 Principle of reversed-phase high performance liquid chromatography

微硅膠表面經烷烴C8和C18處理顯示出非極性，隨著碳鏈的增長非極性增大其疏水性增強，肽溶質的極性越弱，疏水性越強，保留值越大，出峰時間越久[41]，因此色譜柱填料的選擇需要根據待分離的肽溶質的性質進行衡量。反相色譜柱具有使用簡便、高分辨性、高敏感性和分離時間快等優點，但是價格昂貴，洗脫劑通常為有機溶劑，容易污染環境。

2.3.2 反相色譜在肽分離中的應用

在選取反相柱色譜進行肽分離時，流動相一般選擇超純水和乙腈，有時添加體積分數為0.05%～0.1%二氟乙酸、三氟乙酸、螞酸或磷酸。這類酸一方面可以調節洗脫體系中溶液的酸堿度，同時還能作為離子對試劑與肽上的正電荷和極性基團相互作用而減少極性保留問題，增強分離效果，進而改善出峰的峰型、峰寬和拖尾等問題。流速通常控制在0.2～1.0 mL/min，而洗脫方式一般采用梯度洗脫而不是等度洗脫，這主要是因為該方式不僅可以縮短分析周期，提高分離能力，還可以改善峰型，減少拖尾，提高靈敏度。柱溫一般控制在室溫至30 ℃。一般而言，色譜柱填料孔徑的選擇十分重要，主要根據分離肽的分子質量來進行選擇。肽的分子質量一般在240～6 000 Da，而2～5 kDa分子質量肽的孔徑范圍一般選擇130～300 ?(即13～30 nm)，而低于2 kDa一般選擇80～120 ?(即8～12 nm)。利用反相色譜分離肽的具體實例見表3。

表3 反相高效液相色譜柱在肽分離中的應用Table 3 Application of reversed-phase high performance liquid chromatography in the isolation of peptide

肽分子分離前需進行充分溶解，由于肽段同時含有疏水和親水氨基酸，采用單一水相溶解難以達到完全溶解的目的， 需要添加有機相進行助溶如用含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的超純水和乙腈等體積的流動相混合溶解樣品。如果樣品蛋白含量較高，溶解液會出現蛋白質的絮凝現象，此時需要采用0.22 μm針頭濾膜過濾。

以沃特斯XSelect?Peptide CSH C18柱(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm, 130?)分析柱為例，該分析柱通常被用于分離純化3 kDa以下的肽段。由于其柱長較短，相對于150～250 mm的分析柱的流速一般控制在1.0 mL/min，而該分析柱柱長較小，流速一般設置為0.2 mL/min，進樣量設置為2 μL。此外，肽分析柱還有美國aapptec的TR-AA010119 Spirit Peptide C18(4.6 mm×100 mm, 5 μm)，該柱子通常被用于分離合成多肽。以合成多肽為例子，當分離的肽多且峰靠攏，可嘗試調節流動相的洗脫梯度，以提高分離度。但是，如果應用于制備型色譜柱，這將會消耗大量流動相并增加成本。此時，可考慮將樣品進行二次分離純化。

在大量分離多肽時，可以采用島津制備型LC-20AP高效液相色譜系統。Spirit peptide 120 C18(21.2 mm×250 mm, 10 μm)制備型色譜柱可以用于分離5 kDa以下的合成肽分子。此時，流速可以設置到10～30 mL/min，進樣量可以達到10～20 mL，同時通過在HPLC系統中設置流動相的洗脫斜率和水平高度可以實現不同肽餾分的自動收集。此外需要注意的是，采用乙腈作為流動相時，由于乙腈在190 nm存在較強的吸收，對于肽鍵214 nm的測定存在一定的干擾，可以嘗試更換為其他吸收波長如220或254 nm，或者掃描214～280 nm的肽吸收峰確定較佳測定波長。

3 結語與展望

本文對離子交換色譜、分子排阻色譜和反相高效液相色譜等3種色譜技術在肽分離中的應用，從技術原理及其特點、應用實例進行了綜述。總體而言，對于預分離樣品肽的分析和鑒定，一般需要先對原料進行預處理如采用酶進行水解，水解產物可以通過超濾對分子質量不同的肽溶質進行截留分離，再采用色譜技術進一步分離。根據分離肽的類型不同，通常先經過離子交換色譜柱篩選出所需要的電性肽，或經過分子排阻色譜的分子篩的作用選擇篩選不同分子質量的多肽，或根據肽分子極性的不同利用反相HPLC進一步分離。最后，再通過液質聯用技術、超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術和核磁共振等等進一步確定肽的氨基酸序列和空間結構。

伴隨儀器設計科學和人工智能的發展，色譜技術在肽的分離中的應用會不斷朝“多位一體化”的步伐邁進，實現多種方法相結合。例如，有學者同時富集糖肽和磷酸肽中運用離子交換色譜和親水作用色譜，并對2種色譜技術進行了優化和調整[45]。這不僅可以縮短操作程序實現一體化，而且極大地提高科研工作的效率。因此，這不僅為儀器設計者提供了設計靈感，也提出了更高的設計挑戰，需要對設備不斷地改善和優化其單一的技術效果，如靈敏快速的檢測分析系統和定性定量分析能力以跟進實際科研和生產需求。此外，其他有關的肽分離色譜技術也在不斷發展起來，如固相金屬親和色譜分離具有配體專一化的肽，超臨界流體色譜[46]篩選和分離發揮藥理作用的肽，用毛細管電色譜[47]定性和定量分析肽，以及一些環境友好的技術如高靜水壓力和脈沖電場[48]等。還有利用人工智能深度學習開發輔助肽數據庫的檢索和匹配任務，大大提高了肽段鑒定的靈敏度和可靠性[49]。色譜技術及其副產品的發展未來會帶動肽分離取得更大進展，從而提高肽在食品、醫療和化妝品等領域的應用，更好地滿足于市場需求。