UPLC- MS/MS 法測定柑橘中喹啉銅殘留量

王建田，譚顯修，劉喜偉，徐 月，滿益龍，周 勇

（1. 隆回縣七江鎮農業綜合服務中心，湖南 隆回 422205；2. 隆回縣荷田鄉農業綜合服務中心，湖南 隆回 422204；3. 湖南省農業科學院農業生物技術研究所，湖南 長沙 410125）

我國是世界上第一大柑橘生產國，柑橘產業已成為我國南方丘陵山區的農業支柱產業，在國民經濟中占有十分重要的地位[1]。柑橘潰瘍病是全世界范圍內危害柑橘生產的主要檢疫性病害，在我國主要柑橘產區幾乎皆有發生，對柑橘產業造成了嚴重損失[2]。喹啉銅等有機銅制劑是目前化學防治柑橘潰瘍病的理想藥劑，與無機銅制劑相比，其具備良好效果的同時對作物更加安全[3]。然而，過量使用喹啉銅可能會導致病菌產生抗性、農產品質量安全和環境污染等問題。為確保我國柑橘產業綠色高質量發展，農藥減施增效綜合技術體系的建立勢在必行[4]。2021 年9 月3 日實施的食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量（GB 2763—2021）中規定，柑橘中喹啉銅的最大殘留限量為5 mg/kg[5]。

關于喹啉銅在梨[6]、西瓜[7]、楊梅[8]、黃瓜[9]、水稻[10]、馬鈴薯[11]、枇杷[12]、蘋果[13]等基質中的殘留檢測方法已有報道。柑橘中包含果膠、類胡蘿卜素、纖維素等多種成分，基質組成較為復雜，而采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測柑橘中喹啉銅殘留量的方法目前尚無報道。因此，該研究針對柑橘基質，建立了一種以QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理方法為基礎，結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定柑橘中喹啉銅殘留量的方法，旨在為柑橘生產中喹啉銅合理使用和柑橘產品質量安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試柑橘樣品采集于湖南省園藝研究所果樹創新園。

主要試劑有8-羥基喹啉銅（98.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司），乙腈（色譜純，德國默克股份有限公司），甲醇（色譜純，德國默克股份有限公司），甲酸（色譜純，德國CNW 科技公司），PSA、C18、GCB（德國CNW 科技公司），試驗用水為超純水。

主要儀器設備有TSQ Endura 三重四極桿液質聯用儀（賽默飛世爾科技公司），TDZ5-WS 低速離心機（湖南平凡科技有限公司），TG16-II 高速離心機（湖南平凡科技有限公司），ME104 電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]，JY5002 電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），MTV-100 旋渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司），XW-80A 微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品溶液的配制稱取喹啉銅標準品0.025 2 g，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成996 mg/L 的母液。將喹啉銅母液用甲醇稀釋配制成濃度為100 mg/L 的標準溶液，再將100 mg/L 的標準溶液用甲醇稀釋配得濃度為2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L 的系列標準溶液。

1.2.2 基質效應分析使用液相色譜-串聯質譜進行定量分析時通常會出現基質效應，在建立檢測方法時可以按照以下公式對基質效應進行評估：ME（%）=（A/B）×100，當ME 在80%～120%之間時為弱基質效應，無需采取措施補償基質效應；當ME 在50%～80%或120%～150%之間時為中等基質效應，當ME ≤50%或≥150%時為強基質效應，均需采取補償措施[14]。

1.2.3 樣品處理（1）樣品預處理。果肉樣品：先去除柑橘果皮，然后用不銹鋼刀將果肉切成1 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中混勻后進行分取，然后用勻漿機進行勻漿。全果樣品：將柑橘全果用不銹鋼刀切成1 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中混勻后進行分取，然后用勻漿機進行勻漿。（2）樣品前處理。用天平稱取5 g 勻漿后的柑橘樣品至50 mL 離心管中，在離心管中加入提取液；該研究以乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液中添加不同濃度的甲酸（0、0.1%、0.5%）對樣品進行提取；渦旋3 min，4 000 r/min 離心3 min。取2 mL 離心管，預先稱取20 mg 凈化劑（該研究采用PSA、C18、GCB、PSA+C18、PSA+C18+ GCB 共5種凈化材料分別對果肉和全果樣品進行凈化處理），加入1.5 mL 上一步的乙腈提取溶液，漩渦1 min。再置于10 000 r/min 的高速離心機上離心3 min，移取上清液過0.22 μm 濾膜，濾液即可上機測定。

1.2.4 色譜條件優化（1）色譜柱選擇：分別采用Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Mixed-Mode HILIC-1（150 mm×2.1 mm，3 μm）這2 款色譜柱進行檢測，根據分離效果選擇更合適的色譜柱。（2）流動相的確定：分別比較了喹啉銅在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸銨水-乙腈溶液3 種流動相下的響應強度，依據峰形和保留時間確定最佳的流動相。其他色譜條件如下：柱溫35℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

1.2.5 質譜條件優化配制1 mg/L 的標準溶液，使用全掃描模式確定目標物的母離子，優化離子噴霧電壓、噴針溫度、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、射頻透鏡電壓等參數后對二級質譜進行掃描，選擇信號最強的2個子離子作為特征子離子。然后在子離子掃描模式下同時對射頻透鏡電壓和碰撞電壓進行優化，最后確定最佳的質譜參數條件。電離源模式為ESI，電離源極性為正，霧化氣為氮氣，鞘氣壓力為275 790 Pa，離子傳輸管溫度為320℃，噴針溫度為300℃，離子噴霧電壓為3 500 V，采用手動調諧對射頻透鏡電壓和碰撞電壓進行優化，在選擇反應檢測掃描（SRM）模式下進行檢測。

1.2.6 方法驗證（1）標準曲線繪制和基質效應：柑橘基質較為復雜，即使采用凈化劑進行了凈化處理，剩余的基質成分仍然對目標農藥的檢測有干擾。用乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液和空白基質提取液分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L 系列濃度的標準工作液，每個濃度重復測定3 次，采用外標法定量。以進樣質量濃度為橫坐標、對應的峰面積為縱坐標，分別繪制標準曲線。（2）方法的回收率、精密度和定量限：分別采用空白柑橘果肉和全果進行添加回收試驗，添加濃度為0.05、0.1、5、10 mg/kg，每個濃度重復5 次，考察方法的回收率和精密度，以添加的最低濃度作為方法的定量限。

1.2.7 樣品檢測采用建立的方法對購于本地市場和超市的12 個柑橘樣品進行檢測，分別測定果肉和全果中喹啉銅的含量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

優化后選擇信號相對較強的118.111 作為定量離子，相應相對較弱的128.111 作為定性離子，篩選出146.183/118.111 作為定量離子對，146.183/128.111 作為定性離子對，優化碰撞電壓進而得到最佳的離子信號強度，獲得喹啉銅標準溶液的色譜圖如圖1 所示。然后在子離子掃描模式下同時對射頻透鏡電壓和碰撞電壓進行優化，最后確定最佳的質譜參數條件為：保留時間1.23 min，母離子146.183 m/z，子離子118.111/128.111 m/z，碰撞電壓25/22 V，射頻透鏡電壓122 V。

圖1 0.01 mg/L 喹啉銅標準溶液的色譜圖

2.2 色譜條件的優化

試驗結果顯示，使用Hypersil GOLD C18 色譜柱時，溶劑標液出峰峰形較好，但基質匹配標液出峰峰形差；使用Mixed-Mode HILIC-1 色譜柱時，溶劑標液和基質匹配標液出峰峰形均較好，故選擇Mixed-Mode HILIC-1 色譜柱進行洗脫分離。在相同梯度洗脫條件下，比較了喹啉銅在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸銨水-乙腈溶液3 種流動相下的響應強度，結果表明流動相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液時，喹啉銅的峰形更好且響應較高，因此選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作為液相流動相條件。液相洗脫條件如表1 所示。

2.3 提取條件的優化

試驗結果顯示，添加甲酸比不添加甲酸得到回收率更高，推測酸性條件有利于喹啉銅的離子化效率，進而提高添加回收率；添加0.1%和0.5%甲酸得到的回收率結果相當，從節約成本的角度考慮，最終確定甲酸的添加濃度為0.1%。

2.4 凈化條件的優化

試驗結果顯示，采用PSA 對果肉樣品進行凈化、C18 對全果樣品進行凈化，得到的凈化效果較好、回收率結果最佳，故篩選出適合柑橘果肉和全果的凈化劑分別為PSA 和C18。果肉樣品中加入20 mg PSA，全果樣品中加入20 mg C18。

2.5 方法的線性范圍和基質效應評價

由表2 可知，在0.01～2 mg/L 濃度范圍內，喹啉銅的質量濃度和峰面積呈良好線性關系，決定系數分別為0.998 2、0.998 9 和0.999 4；柑橘果肉和全果的基質效應分別為48%和42%，均為基質減弱效應。

表2 標準曲線和基質效應

2.6 方法的回收率、精密度和定量限

由表3 可知，在0.05、0.1、5、10 mg/kg 4 個添加水平下，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的平均回收率分別為99%～103%、91%～97%，RSD分別為1.9%～6.1%、3.0%～8.4%，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的定量限均為0.05 mg/kg，結果符合NY/T788—2018[15]的要求。柑橘果肉、全果空白樣品的色譜圖見圖2，添加樣品色譜圖見圖3。

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 加標樣品色譜圖（0.1 mg/kg）

表3 喹啉銅在柑橘果肉和全果中的添加回收率和相對標準偏差（n=5）

2.7 樣品檢測

采用優化后的提取檢測方法對購于本地市場和超市的12 個柑橘樣品分別進行果肉和全果檢測，結果顯示，12 個樣品果肉中喹啉銅的含量范圍為≤0.15

mg/kg，全果中喹啉銅的含量范圍為≤0.32 mg/kg。

3 結 論

該研究使用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測柑橘中喹啉銅的殘留量，對樣品處理方法、色譜條件和質譜條件進行了優化。結果表明：樣品經含0.1%甲酸的乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液渦旋提取，果肉樣品使用20 mg PSA 凈化，全果樣品使用20 mg C18 凈化；采用Mixed-Mode HILIC-1色譜柱分離，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作流動相進行梯度洗脫，洗脫流速為0.3 mL/min，柱溫為35℃；在選擇反應檢測掃描（SRM）模式下進行測定，喹啉銅在0.01～2 mg/L 范圍內性關系良好，決定系數均≥0.998 2，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的最低檢測濃度均為0.05 mg/kg，添加回收試驗中喹啉銅在柑橘果肉和全果中的平均回收率范圍為91%～103%，相對標準偏差范圍為1.9%～8.4%。該方法操作簡便、快速，準確度和精密度高，適用于柑橘中喹啉銅殘留量的檢測。