PLAG1與家畜脊椎數(shù)目體格形態(tài)相關性研究

文│劉紫雯 史曉淵 王天琦 王長法*（聊城大學農學與農業(yè)工程學院）

哺乳動物的骨骼主要由中軸骨、附肢骨和帶骨3個部分組成，其中中軸骨又包括頭骨、脊柱、胸骨和肋骨。不同的骨骼形態(tài)大小功能各不相同，并且在胚胎發(fā)育早期，骨骼的形態(tài)、數(shù)目及功能屬性就已被確定，若此過程被擾亂則會導致骨骼發(fā)育障礙，造成先天性或后天性骨骼疾病。馬屬動物多形性腺瘤1（Pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1）基因是一個鋅指蛋白編碼基因，含有3個外顯子，其所在的PLAG基因家族還有兩個成員：PLAGL1和PLAGL2，比對PLAG1、PLAGL1和PLAGL2三者所編碼產物的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)具有廣泛的相似性，但具有不同的表達時期、范圍、峰值等。在過去的研究中發(fā)現(xiàn)，PLAG1與各種腫瘤和青光眼的發(fā)病有關，但在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，此基因還與脊椎動物椎骨數(shù)量及體格形態(tài)有明顯的聯(lián)系。筆者闡述了PLAG1的研究進展，以期為PLAG1在馬屬動物分子育種研究中奠定基礎。

一、PLAG家族

1997年，Cas等在研究多形性腺瘤時發(fā)現(xiàn)，在8q12處均有相同的斷裂點，經熒光原位雜交等方法對其進行深入分析，發(fā)現(xiàn)受染色體畸變影響的靶基因是PLAG1基因，它可編碼一種新的鋅指蛋白。目前研究結果認為，t（3；8）染色體異位使位于3號染色體的β輔肌動蛋白基因的啟動子序列和位于8號染色體的PLAG1基因序列發(fā)生互換可能是導致PLAG1基因激活表達的主要原因。1998年Cas團隊在此基礎上進行了更加深入的研究，再次證明了PLAG1是一種由于8q12染色體畸變，因為啟動子序列的替換而被激活的蛋白質編碼基因。通過分離、鑒定、比較兩個新的編碼C2H2鋅指蛋白的DNA序列，發(fā)現(xiàn)了PLAG基因家族的另外兩個成員：PLAGL1和PLAGL2。并且這兩個新發(fā)現(xiàn)的PLAG家族成員編碼的蛋白質，其一級結構在氨基酸末端鋅指區(qū)，特別是在PLAG1和PLAGL2的最后30個氨基酸之間，顯示出很高的序列一致性。后來發(fā)現(xiàn)，PLAG家族的3個成員之間，N端的DNA結合域具有高度同源性，PLAG1和PLAGL1之間的同源性為73%，PLAG1和PLAGL2之間為79%，但C端的反式激活功能域同源性很低，PLAG1的C端與PLAGL1的同源性僅為19%，與PLAGL2的同源性為35%。PLAGL1位于染色體6q24-25上的一個印跡區(qū)，與PLAG1的多向致癌潛能不同，它是一種抑癌基因。與PLAGL1相比，PLAGL2不僅在結構上，在功能上與PLAG1也有更密切的聯(lián)系。PLAGL1的羧基末端在上皮細胞和間充質細胞中表現(xiàn)出較強的轉錄活性，但PLAG1和PLAGL2在間充質細胞中只有在抑制區(qū)耗盡后才能激活。Declercq等研究PLAG基因家族如何影響細胞增殖和凋亡時發(fā)現(xiàn)，生長因子2（IGF-2）基因在唾液腺瘤中的表達高度上調，并且在IGF-2的啟動子3中發(fā)現(xiàn)了潛在的PLAG1結合位點，提示PLAG1與細胞增殖相關生命活動有一定的關系。Zheng等通過體內蛋白質翻譯后修飾實驗證實PLAG1編碼的244、263和353位氨基酸是蛋白質翻譯后修飾的靶點，進一步研究證實蛋白質翻譯后的修飾能抑制IGF-2的表達。PLAG1和PLAGL2接受乙酰化的調節(jié)，可被p300乙酰化和激活，可被NDAC7去乙酰化和抑制。小泛素相關修飾物（small ubiquitin—related modifier，SUMO）效應是一條三步驟酶信號通路，代表靶基因的轉錄活性，Yang等證實，SUMO效應在PLAG1和PLAGL2轉活中發(fā)揮相反作用。SUMO效應的測定證實了PLAG1的244、263和353位氨基酸和PLAGL2的250、269和356位氨基酸為SUMO效應位點，且SUMO效應抑制PLAG1誘導的IGF-2表達。Alam等分析了PLAG基因家族在小鼠神經系統(tǒng)中的表達，發(fā)現(xiàn)這3個基因都在大腦皮層決定神經元命運的時候進行表達，提示PLAG基因家族可以影響大腦皮層祖細胞做出細胞命運選擇。Cas等還發(fā)現(xiàn)，小鼠ZAC-1和人類PLAGL1之間的同源部分不包括ZAC-1中存在的34個PLE、PMQ和PML重復序列，也不包括這兩種蛋白質的羧基末端，提出ZAC1可能是PLAG蛋白質家族的第四成員。

二、PLAG1的結構、功能和分布

人類PLAG1基因位于8號染色體長臂q12處，cDNA全長7317nt，包含5個外顯子，編碼框長度為1503bp，其表達產物PLAG1鋅指蛋白由501個氨基酸構成。雖然PLAG1基因有5個外顯子，但這5個外顯子并不都能參與編碼翻譯，PLAG1基因的前3個外顯子因缺少編碼相應的啟動子序列而不能參與翻譯，第4個外顯子包含編碼起始密AUG，第5個外顯子中有編碼終止密碼UAA，因此PLAG1是從第4外顯子的最后端和第5外顯子的起始端開始編碼翻譯。豬的PLAG1基因位于4號染色體上，包含4個外顯子，全長50134nt，mRNA轉錄體有3個亞型，但只編碼兩種蛋白質，X1和X2亞型mRNA編碼Ⅰ型蛋白質，由499個氨基酸構成，CDS序列均長為1500nt；X3型mRNA編碼Ⅱ型蛋白質，由417個氨基酸構成。牛的PLAG1基因位于14號染色體，含有4個外顯子，全長51953nt，含有3種轉錄本亞型，X1型轉錄本編碼499個氨基酸殘基組成的蛋白質，X2和X3型轉錄本編碼完全相同的417個氨基酸組成的蛋白質。馬的PLAG1基因定位在9號染色體上，包含5個外顯子，全長53146nt，mRNA轉錄體也有3種亞型，編碼蛋白質情況與豬相同，都編碼由499和417個氨基酸組成的蛋白質。羊的PLAG1基因位于9號染色體上，全長12750nt，包含3個外顯子；驢的PLAG1基因定位于12號染色體（本課題組組裝版本，尚未公布），已知包含3個外顯子，2個內含子，全長6801nt（86316851-86323651），與豬和馬不同，驢的mRNA轉錄體只有兩種，X1型包含3個外顯子，2個內含子；X2型包含2個外顯子，1個內含子。X1型編碼蛋白含有499個氨基酸，X2型編碼蛋白含有417個氨基酸。圖1為多物種PLAG1基因的進化樹分析及序列比對結果，可見在多個物種中序列相似性較高，說明PLAG1基因具有較高的保守性。如圖2所示，在多個物種中，PLAG1基因與CNCND7和MOS基因連鎖性較強，總是同時出現(xiàn)。

◎圖1 多物種PLAG1基因的序列比對結果

PLAG1是在染色體8q12異常（通過啟動子交換或啟動子替換）而被激活的一種鋅指蛋白編碼基因。在許多人類腫瘤疾病中，PLAG1的激活是一個重要事件。微陣列分析表明，PLAG1的致癌能力可能是由IGF-2的有絲分裂信號通路介導的。PLAG1編碼產物以一種特定方式結合DNA，這種結合主要利用鋅指蛋白7根鋅指中的3根，鋅指6和7與核心相互作用，鋅指3與G-簇相互作用。PLAG1、PLAGL1和PLAGL2的羧基末端結構域的亞區(qū)在哺乳動物細胞中與特定的DNA結構域連接時顯示出不同的轉錄激活能力，從而證明這些蛋白質可以作為轉錄的正調控因子發(fā)揮作用。分析表明，PLAG1（Asp-385-Gln-500）和PLAG-2（Pro-382-Gln-496）中羧基末端的第二部分含有必需的轉錄激活域。Braem等利用酵母雙雜交系統(tǒng)，鑒定出核外激素α2與PLAG1相互作用。體外谷胱甘肽S-轉移酶下拉試驗證實了PLAG1與核外激素α2之間的物理相互作用。核外激素α2通過與由短鏈堿性氨基酸組成的核定位序列（NLS）相互作用，將蛋白質護送到細胞核中。PLAG1的輸入受其鋅指結構域和核苷α2識別位點NLS1的控制。Alam等重點分析了PLAG基因在小鼠神經系統(tǒng)發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)PLAG基因在中樞和外周神經系統(tǒng)中以單獨和部分重疊相結合的表達模式進行，雖然PLAG基因家族的3個成員在某些譜系中共同表達，但它們在其他組織中也表現(xiàn)出獨特的、在時空上互補的表達模式。許多研究表明，PLAG家族編碼蛋白是核蛋白的轉錄調節(jié)因子，調控體內許多重要基因的表達。PLAG基因在祖細胞群和有絲分裂后的神經元中都有表達，這表明它們在神經發(fā)育、控制細胞命運或增殖決定中既發(fā)揮早期作用，還可能參與后期分化過程。圖3為多個數(shù)據(jù)庫中PLAG1的功能性結構區(qū)域展示圖。

◎圖2 PLAG1及其鄰近基因示意圖

三、PLAG1在生物發(fā)育過程中的作用

脊椎的發(fā)生發(fā)育是一個極其復雜的過程，涉及多個信號傳導通路及基因家族，如Hox基因家族及其信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路、FGF信號通路及RA信號通路等，這些信號通路及基因通過協(xié)同合作對動物椎骨的形成進行周期性調控，以確保其正常的形成及分化。自1997年發(fā)現(xiàn)PLAG家族成員以來，人們已經逐步認識到了PLAG家族的結構和功能，大量數(shù)據(jù)表明，此基因家族在調控脊椎動物椎骨數(shù)量方面發(fā)揮重要作用，但它們的信號途徑、在復雜過程中的潛在作用等方面還有待研究。

研究發(fā)現(xiàn)，牛14號染色體上的PLAG1基因與牛的身高有關。PLAG1在垂體中大量表達，雖然下丘腦也含有表達PLAG1的細胞，但PLAG1的基因敲除并沒有使下丘腦合成產物的表達水平發(fā)生顯著改變，因此Juma等認為，PLAG1缺乏會降低小鼠生殖能力，但對雄性小鼠下丘腦-垂體系統(tǒng)的生殖控制并沒有發(fā)揮主要影響。除了調控轉錄、控制代謝外，染色質包裝可能是鋅指蛋白發(fā)揮其調控作用的重要途徑。PLAG1和NCAPGLCORL，兩者都被稱為成人身高基因座，在牛、馬、狗和豬的體重/身高選擇性掃描中都被檢測到，研究表明，這些基因座對哺乳動物的生長過程和體型大小有顯著影響。牛的進化以體型變化最為明顯，Utsunomiya等對自新石器時代以來的牛體尺數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)PLAG1基因在牛體尺變化中起重要作用。遺傳多態(tài)性對牛的性狀改良具有重要影響，家族的多態(tài)性將極大地改變牛的生長性狀，徐偉等對566頭牛混合DNA樣本進行測序以檢驗PLAG1多態(tài)性與生長性狀之間的關系，在PLAG1基因內部檢測到一個19bp的Indel突變，PCR結果顯示3個基因型和2個等位基因：142bp（W）和123bp（D），其中WW基因型和W等位基因型在研究群體中占優(yōu)勢。趙拴平等以安徽大別山牛為試驗群體，采用PCR和直接測序技術檢測PLAG1基因的多態(tài)性，在PLAG1基因第1內含子區(qū)檢測到了上述徐偉等檢測到的19-bp Indel位點，3’UTR區(qū)檢測到1個變異位點g.48316C＞T，二者均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50），其中19-bp Indel位點偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，推測這個19bp的Indel位點可能是普遍存在于各牛品種中。除了上述19-bp Indel位點，吳慧等選取5個品種的744只綿羊，DNA混池測序后發(fā)現(xiàn)PLAG1基因中存在兩個Indel位點（均位于內含子1中），對這兩個Indel位點進行相關分析，結果顯示具有較高的遺傳多態(tài)性，并且與成年羊的體重及體格大小顯著相關（P＜0.05）；徐洪偉等選取了來自7個綿羊品種的2350只綿羊，全基因組分析顯示，在CHCHD7基因下游2758bp的位置有一個8bp的缺失，將此indel位點與上述吳慧等的研究結果進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，這兩個基因的缺失變異雖然不存在強連鎖，但是與灘羊的生長性狀存在顯著相關性（P＜0.05）。An等對463頭日本和牛的體尺性狀進行了全基因組關聯(lián)分析，分別檢測到18個、5個和1個與尻高、體高和體長性狀相關的SNP，其中與尻高有關的SNP位點就定位于PLAG1基因內。另有研究表明，中國牛品種如秦川牛、品安牛、咸安牛和嘉縣紅牛的部分位點具有多態(tài)性，相關分析表明，該多態(tài)性與這些牛品種的身高有關。Zhang等在研究中國桐城大白豬NR6A1、PLAG1和VRTN基因多態(tài)性與椎骨數(shù)量的關系時，應用全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，NR6A1、PLAG1和VRTN與豬的椎骨數(shù)量顯著相關（P＜0.05）。

◎圖3 驢PLAG1基因功能性結構展示圖

四、PLAG1的突變及其生物學功能

研究發(fā)現(xiàn)，超過一半的腫瘤顯示出反復的染色體異常，其中8號染色體的重排最為頻繁（超過50%），通常涉及8q12帶，最常見的畸變是t（3；8）（p21；q12），3p21為優(yōu)先異位伙伴。β-連環(huán)蛋白是黏附連接和WG/WNT信號通路中作用的一種界面蛋白，t（3；8）（p21；q12）導致PLAG1和β-連環(huán)蛋白（CTNNB1）組成性表達基因之間的啟動子交換。Voz等為了評估異位伙伴對PLAG的重要性，他們將另一個異位：t（5；8）（p13；q12）融合在兩個基因的5’非編碼區(qū)，在保留編碼序列的同時交換調控元件，該異位突變導致了白血病抑制因子受體的廣泛表達。Li等在研究PLAG1基因在不同組織不同發(fā)育時期的表達時發(fā)現(xiàn)，其在所有組織中均有表達，但在5月齡和36月齡的成年牛中表達量差異極顯著（P＜0.01），且存在兩種變異體，相關性分析表明，這兩個變異體與生長性狀相關聯(lián)。Song等采用全基因組關聯(lián)分析來鑒定與胴體性狀相關的遺傳變異，利用壓縮混合線性模型對1141頭中國西門塔爾牛的770K基因型單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)進行了全基因組關聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)17個顯著相關的SNP位點，在PLAG1-CHCHD7基因區(qū)內發(fā)現(xiàn)一個多效的數(shù)量性狀核苷酸（QTN），命名為BovineHD1400007259（p＜10-8），它控制著關節(jié)、二頭肌和小腿性狀的變異。

據(jù)筆者所知，PLAG1基因在馬屬動物身上至今還沒有深入的研究。本課題組進行驢的屠宰試驗發(fā)現(xiàn)，德州驢的胸椎（thoracic vertebra）數(shù)一般為17～19根，腰椎(Lumbar vertebra)數(shù)一般為5～6根，并且胸腰椎數(shù)的組合主要存在5種類型：L5T17（2.8%）、L5T18（76.5%）、L5T19（0.9%）、L6T17（10.4%）、L6T18（9.5%），其中L5T18占比最高。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，德州驢多一根胸椎體長增加4.3厘米，多一根腰椎體長增加2.4厘米，多一根椎骨凈肉重增加7.2千克，皮重增加0.65千克，由此可見選育多胸腰椎數(shù)的親代驢對驢產業(yè)具有較大的經濟效益。胸腰椎數(shù)目變異與驢的經濟效益相關，因此在驢的分子育種領域對與胸腰椎數(shù)有關的分子標記進行更加深入的研究意義重大，基于PLAG1在其他動物身上已經獲得的研究結果我們推測，此基因可作為研究驢胸腰椎數(shù)有關的候選基因。

綜上所述，PLAG1基因不僅與各種腫瘤、癌癥、青光眼有關，還與多種動物的椎骨數(shù)量、骨密度、體高、體長等生長性狀密切相關，雖然單獨PLAG1基因內部的突變并不能直接帶來動物表型的改變，但研究其突變對于探索基因如何調控動物的生長性狀具有不可忽視的作用，它與不同基因的協(xié)同作用也許就是未來分子育種的一大助力。