硫利達(dá)嗪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26.WT 免疫原性細(xì)胞死亡的作用及機(jī)制研究

林靜，許文超，劉柳，汪毅，孫祥

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽 合肥 230001)

0 引言

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer,CRC) 的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)居惡性腫瘤第3 位[1]，近年來中國(guó)的發(fā)病率和死亡率亦不斷上升[2]。雖然手術(shù)和化療在結(jié)直腸癌治療中起著重要作用，但其療效仍很局限[3]，且存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，需要不斷尋找更有效的臨床療法[4,5]。目前硫利達(dá)嗪(thialidazine,THZ)作為一種抗精神疾病藥物在腫瘤治療中處于探索階段，其抗腫瘤作用及機(jī)制仍是較少被關(guān)注的領(lǐng)域[6,7]。硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡及其機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究通過觀察硫利達(dá)嗪對(duì)CT26.WT 增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步探討其在誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞免疫原性死亡中的機(jī)制，為結(jié)直腸癌治療提供了新思路，也為臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)藥物

結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT26.WT 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存；硫利達(dá)嗪購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MTT 試劑盒購(gòu)自Sigma 公司；Annexin V-FICT/PI 雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD 公司；CRT 抗體購(gòu)自Abcam 公司；Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP、PERK、Phospho-eIF2α、ATF-4、CHOP、BIP、HMGB1 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；β-Actin 及所有二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL 超敏發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo 公司。倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀FACS Calibur 購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 CT26.WT 細(xì)胞株培養(yǎng)

細(xì)胞置于37℃，含有5% CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中，在含雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)及密度等情況定時(shí)傳代。以下所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

細(xì) 胞 以4×104個(gè)/mL，每 孔100μl 接 種 于96 孔板，邊緣孔均以無菌PBS 填充。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁并呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每孔更換含不同濃度THZ(10、20、25、30 、35 、40 、45、50 μmol/L) 的培養(yǎng)基。各組設(shè)5 個(gè)副孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組。培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清，再加入 DMSO150 μL 后室溫下振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490nm 波長(zhǎng)處測(cè)得每孔吸光度值(optical density, OD 值)，計(jì)算出抑制率=(對(duì)照組吸光度均值-實(shí)驗(yàn)組吸光度均值)/對(duì)照組吸光度均值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞以1×105個(gè)/mL，2mL/孔接種于6 孔板，孵育至貼壁后換液。對(duì)照組更換1640 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度10、20、30、40、50μmol/L 的THZ，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞(包括上清細(xì)胞)，PBS 預(yù)冷洗滌2 遍棄上清，加入5μlAnnexinV-FITC 和5μl PI震蕩混勻后室溫避光孵育15min，再次PBS 清洗、離心、重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早凋和晚凋情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CRT 表達(dá)率

細(xì)胞的培養(yǎng)、收集同上，將收集的細(xì)胞懸液加入CRT 一抗(1：1000)，避光條件下室溫孵育30min，PBS 離心洗滌兩遍，用熒光色素PE 標(biāo)記的IgG 二抗孵育1h，PBS 洗滌重懸，采用間接流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白CRT 的表達(dá)率。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，對(duì)照組(0μmol/L)和實(shí)驗(yàn)組(10、20、30、40、50μmol/L)THZ 預(yù)處理24 小時(shí)后，收取細(xì)胞樣本(約1×105個(gè))，加入RIPA 細(xì)胞裂解液裂解后離心收集上清液得到總蛋白，按照1:4 加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱15 分鐘使蛋白充分變性，把蛋白樣品冷卻至室溫后以5-10ul/孔上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)，恒壓80v 電泳1h后恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜，洗去轉(zhuǎn)膜液后加入封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2h。參考一抗說明書用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋，4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。參考一抗的屬性和二抗說明書，按照1:20000 用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.2h。PBST 洗滌3 次后使用ECL 發(fā)光并顯影定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次及3 次以上，采用SPSS 20.0 及GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SD 表示，采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫利達(dá)嗪對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，在一定的范圍內(nèi)，THZ 對(duì)CT26.WT 的增殖抑制效應(yīng)與濃度呈正相關(guān)。不同濃度(10、20、25、30、35、40、45、50μmol/L)的藥物作用24h，各組的增殖抑制率分別為(8.327±3.748)%、 (21.385±2.372)%、(43.872±4.355)%、(68.023±3.808)%、 (79.569±5.504)%、(85.807±3.793)%、(87.783±2.519)% 和(91.067±1.960)%。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=439.368, P＜0.01)(圖1B)。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見隨著藥物濃度增加，正常細(xì)胞數(shù)量減少、輪廓不清、間隙增加，貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞呈漂浮狀(圖1A)。通過SPSS 20.0 軟件計(jì)算得出，THZ 對(duì)CT26.WT 半數(shù)抑制濃度(IC50)值為25.373μmol/L。

圖1 硫利達(dá)嗪對(duì)CT26.WT 細(xì)胞增殖的影響

2.2 硫利達(dá)嗪對(duì)細(xì)胞的凋亡作用

流式細(xì)胞術(shù)采用 AnnexinV-FITC/PI 雙染分析細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，0、10、20、30、40、50 μmol/L的THZ 作用于CT26.WT 細(xì)胞24h 后，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。各組的凋亡率分別為(0.175±0.170)%、 (14.073±3.817)%、(24.250±3.424)%、(40.437±1.186)%、 (44.783±2.076)%和(47.073±3.821)%。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=137.480, P＜0.001)(圖2)。在THZ 濃度超過30 μmol/L 后，隨著濃度的增加，凋亡率無明顯上升(P=0.08)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度硫利達(dá)嗪作用24 小時(shí)后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 硫利達(dá)嗪對(duì)細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白CRT 表達(dá)的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)照組(0μmol/L)的CRT 陽(yáng)性表達(dá)率為(0.399±0.597)%，經(jīng)10、20、30、40、50 μmol/L的THZ 作用24h 后，細(xì)胞表面CRT 的表達(dá)率分別為 (16.900±1.054)%、(24.433±4.102)%、(45.967±2.616)%、(79.500±7.732)%和(90.733±5.843)%。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=195.330, P＜0.01)，且隨著THZ濃度的增加，細(xì)胞表面CRT 表達(dá)上升。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度硫利達(dá)嗪作用24 小時(shí)后對(duì)鈣網(wǎng)蛋白CRT 表達(dá)的影響

2.4 硫利達(dá)嗪對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

濃度為0、10、20、30、40、50μmol/L 的THZ 分別作用于CT26.WT 細(xì)胞24 h 后，與對(duì)照組相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK、Phospho-eIF2α、ATF-4、CHOP、BIP、HMGB1 及線粒體凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP 表達(dá)上調(diào)，且相對(duì)表達(dá)量在20μmol/L 時(shí)最多。當(dāng)THZ 濃度超過20μmol/L時(shí)，隨著濃度的升高，我們發(fā)現(xiàn)CT26 的相關(guān)蛋白表達(dá)量整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，THZ 處理濃度為30μmol/L 時(shí)，其誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞比率 較10μmol/L 上 調(diào)2 倍 以 上(40.437±1.186)% VS (14.073±3.817)%，蛋白表達(dá)下調(diào)可能與CT26細(xì)胞凋亡發(fā)生多，蛋白合成能力不足有關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

腫瘤的低免疫原性和免疫逃逸可導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8,9]。最近研究表明某些化學(xué)藥物等作用于腫瘤細(xì)胞可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激反應(yīng)，從胞內(nèi)釋放免疫信號(hào)分子來提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，這個(gè)過程導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡即為腫瘤的免疫原性細(xì)胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)[10-13]。作為一種廣泛用于治療精神疾病的吩噻嗪類藥物[14]，硫利達(dá)嗪還可以通過誘導(dǎo)凋亡和調(diào)節(jié)抗凋亡信號(hào)通路活性來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[15-17]。誘導(dǎo)ICD 是一種恢復(fù)“冷”腫瘤免疫原性的具有前景的方法，它可以利用固有和適應(yīng)性成分來啟動(dòng)腫瘤微環(huán)境(TME)以獲得更大的抗腫瘤反應(yīng)。ICD 為刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)提供了新途徑。本課題研究組已證實(shí)硫利達(dá)嗪能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞ICD 的發(fā)生，而在結(jié)直腸癌細(xì)胞中尚未見相關(guān)報(bào)道[18,19]。

圖4 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平的改變

損傷相關(guān)分子(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)[20-23]的釋放與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未蛋白折疊反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)相關(guān)[24,25]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高應(yīng)激條件下，BIP/GRP78 表達(dá)明顯上調(diào)，產(chǎn)生 PERK -eIF2α、ATF6-ERSE、和IRE1- XBP1s 三條主要信號(hào)通路來進(jìn)行UPR[26-30]。激活UPR 通路中PERK 能夠引起ICD 的發(fā)生，并且PERK 的激活能引起eIF2α 的磷酸化，進(jìn)而引發(fā)CRT 膜轉(zhuǎn)位[31,32]。我們的結(jié)果也顯示，硫利達(dá)嗪能夠使PERK 及eIF2α 的磷酸化水平升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。硫利達(dá)嗪介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性氧生成可導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促凋亡蛋白CHOP 的過表達(dá)證明了這一點(diǎn)，該蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的標(biāo)志[33-36]。且在一定范圍內(nèi)，CHOP 水平隨著藥物濃度的增加進(jìn)一步升高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的CRT 膜轉(zhuǎn)位是ICD 的核心事件。樹突狀(DC)細(xì)胞與CRT 結(jié)合后生長(zhǎng)為成熟DC 細(xì)胞，并將腫瘤抗原呈現(xiàn)給T 細(xì)胞以激活后續(xù)的免疫反應(yīng)[37]。本研究結(jié)果表明硫利達(dá)嗪促進(jìn)了CT26.WT 細(xì)胞表面CRT 的表達(dá)。有研究將CRT 與腫瘤抗原嵌合，大大提升了腫瘤抗原免疫原性[38]，這也為后續(xù)研究提供了新思路。

嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的破壞可能導(dǎo)致Ca2+的泄漏，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體相關(guān)細(xì)胞的凋亡[39]。這可以通過Caspase 裂解水平的增加來證明[40]。本實(shí)驗(yàn)Western blot 結(jié)果提示硫利達(dá)嗪顯著誘導(dǎo)Caspase-9 和Caspase-3 的裂解。DNA 損傷時(shí)，細(xì)胞需產(chǎn)生大量的PARP 用于DNA 修復(fù)，以維持細(xì)胞存活[41]，故而出現(xiàn)了本實(shí)驗(yàn)中見到的PARP 的表達(dá)增加。結(jié)合Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，提示硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)發(fā)生了線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡，這與課題組之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[42]。

藥物再利用(或重新定位)和藥物組合是近年來眾多研究團(tuán)體關(guān)注的治療策略。我們的數(shù)據(jù)表明硫利達(dá)嗪在體外能夠顯著誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促使細(xì)胞發(fā)生ICD，抑制結(jié)直腸癌CT26.WT 細(xì)胞增殖，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中，其在體內(nèi)能否協(xié)同免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞仍需研究探索。由于硫利達(dá)嗪安全性和毒性相對(duì)明確，增加了藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)的可能性。藥物組合的方式可以一定程度上克服腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性，此外可能會(huì)影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤特異性免疫反應(yīng)以加速腫瘤細(xì)胞的清除。還需要更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證硫利達(dá)嗪與傳統(tǒng)結(jié)直腸癌化療藥物或免疫療法聯(lián)合的療效。