枸杞多糖對人視網膜色素上皮細胞光損傷保護的實驗研究*

李 娟，高園園，黃 潔，楊曉旭，趙芳芳，俞 洋，5△

(1.寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；3.寧夏回族自治區中西醫結合醫院，寧夏 銀川 750021；4.銀川國龍醫院，寧夏 銀川 750004；5.寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是引起西方國家50歲以上老年人低視力和盲的首要原因[1]。在我國隨著生活水平的提高，AMD發病率也呈逐年上升趨勢。RPE光損傷可能是視網膜光損傷的關鍵，AMD與RPE細胞光損傷密切相關[2]。前期研究顯示：枸杞子對RPE細胞具有一定的保護作用[3-4]，枸杞子作為中國傳統的藥食同源食物，其富含枸杞多糖、多種氨基酸、甜菜堿、微量元素、維生素、生物堿、脂肪酸等化學成分，其中，枸杞多糖(LBP)作為枸杞子主要的有效成分，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等單糖成分組成，具有諸多重要的生理功能。目前受提取工藝的影響，導致成品枸杞多糖的純度不一，為研究此種差異對視網膜光損傷保護的影響，本實驗選取純度為50%、65%的LBP，以人RPE為研究對象，觀察LBP對光誘導人RPE細胞凋亡的影響，探討不同純度枸杞多糖對人RPE細胞光損傷保護的作用機制，提高枸杞多糖在臨床應用的利用率。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)，購于BNCC。

1.2 主要試劑與藥物 50%、65%純度LBP(北京索萊寶生物有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM/F12(美國 HyClone 公司)；青霉素-鏈霉素混合液、胰蛋白酶(北京索萊寶生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(美國HyClone 公司)；CCK8 檢測試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；Bcl2 Antibody(美國Proteintech公司，貨號12789-1-AP)；Bax Antibody(美國Proteintech公司，貨號50599-2-Ig)；Caspase-3 Antibody(美國CST公司，貨號9662S)；Caspase-9 Antibody(北京博奧森公司，貨號bs-0050R)。

1.3 主要儀器 Multiskan 酶標儀(Thermo 公司)；FACSAriaⅡ型流式細胞檢測儀(美國 BD 公司)；TES-1332A 數位式照度計(臺北泰仕電子工業)。

1.4 實驗方法

1.4.1 配制安全濃度LBP溶液 分別稱量(50%，65%)LBP粉末各5 mg，用5 mL DMEM/F12完全培養基溶解，渦旋振蕩制成終濃度為1 mg/mL LBP原液；取上述原液用0.22 um無菌過濾器滅菌過濾后，用DMEM/F12完全培養基稀釋10倍，制成終濃度為0.1 mg/mL LBP溶液。

1.4.2 細胞培養 配制含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM/F12完全培養基。將ARPE-19置于 5%CO2、37°C的培養箱中培養，約每2 d換液1次，待倒置顯微鏡下見細胞鋪滿瓶壁約80%～90%，用含EDTA胰蛋白酶消化液消化細胞，于顯微鏡下觀察，當細胞變成小圓點并浮起時，立即用完全培養基終止，以1∶3比例傳代，取2～4代細胞用于實驗。

1.4.3 構建人RPE細胞光損傷模型 選2～4代人 ARPE-19 細胞培養于6孔板，將自制三基色LED冷光燈置于培養箱內頂端，采取直落式照射。根據預實驗結果，測定光照強度和光照時間，使被照細胞同一水平的光照強度為(16500±500)Lux，用上述光照器照射細胞24 h。培養箱內溫度變化控制在 36.5～37.5 ℃之間，排除溫度升高引起細胞光熱損傷的可能，正常組用錫紙包裹，其他各組細胞均在相同培養箱內培養。

1.4.4 實驗分組 正常人RPE細胞組(正常組)、正常人RPE細胞+光照射組(模型組)、正常人RPE細胞+光照+50%枸杞多糖組(低純度組)、正常人RPE細胞+光照+65%枸杞多糖組(高純度組)，于光照24h給予指標檢測。

1.4.5 CCK8法檢測細胞存活率 選取生長狀況良好的細胞用胰酶消化后，接種于96孔板(密度約5×103個/孔)。用無血清DMEM/F12于培養箱中孵育過夜以同步化細胞。各組于光照結束后終止培養，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育 2.5 h。酶標儀檢測 450 nm 處各孔的OD值并計算細胞存活率。

1.4.6 流式細胞儀測定細胞凋亡率 各組細胞于光照處理結束后，收集舊培養液，用溫 PBS 洗滌 2 遍，胰酶消化并收集細胞于離心管中，用冷 PBS 洗滌3遍，用 400μL AnnexinⅤ結合液懸浮細胞，再加入 5 μL FITC 避光孵育15 min，上機前 5 min 避光加 10 μL PI，在1 h內完成流式細胞儀檢測。

1.4.7 Western blot 法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平 用蛋白裂解液提取各組細胞蛋白，利用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量檢測，以50 μg蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜，加入一抗，4℃封閉過夜，TBST洗滌10min3次，加入HRP標記的二抗，暗室中加發光液并進行曝光。采用Image-J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

2 結果

2.1 枸杞多糖對光誘導ARPE-19 細胞損傷的影響 與正常組比較，模型組細胞存活率顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖(50%、65%)干預組細胞存活率顯著升高(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組細胞存活率顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 枸杞多糖對光誘導 ARPE-19細胞存活率的影響

2.2 枸杞多糖對光誘導ARPE-19細胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖高、低純度組細胞凋亡率明顯呈下降趨勢(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組細胞凋亡率呈下降趨勢(P<0.05)。見表2、圖1。

正常組

模型組

50%枸杞多糖組

65%枸杞多糖組

A.正常組；B.模型組；C.50%枸杞多糖組；D.65%枸杞多糖組

表2 枸杞多糖對光誘導ARPE-19 細胞凋亡率的影響

2.3 枸杞多糖對光誘導ARPE-19細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖各純度組中Bax 、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達呈下降趨勢，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯上升(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組中Bax、 Caspase-3、Caspase-9蛋白表達呈下降趨勢，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值呈上升趨勢(P<0.05)。見表3、圖2。

A.正常組 B.模型組 C.50%枸杞多糖組 D.65%枸杞多糖組

表3 枸杞多糖對光誘導人RPE細胞Bax、Bcl-2、Bcl-2/bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達的影響

3 討論

AMD是一種引起視網膜黃斑區光感受器和視網膜色素上皮退行性改變和新生血管生成為特征的年齡相關性疾病，由于視覺的高分辨率及色覺辨別主要依靠于黃斑，因此AMD可以引起嚴重的視覺障礙甚至永久失明[5]。其主要表現為脈絡膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)及黃斑部出血、滲出，導致瘢痕組織生成，破壞中心部視網膜。AMD的發病率高，已成為致盲的重要因素，但可以得到治療的患者卻極其有限，因此對AMD病因病機探討成為眼科學的研究熱點。中醫學將AMD歸為“視瞻昏渺”、“視物異形”、“暴盲”等范疇，與肝、脾、腎的功能失調有關。現代中醫學者認為肝腎陰虛、精血耗傷為本病發病的根本病機，陰虧血少可以致瘀；同時陰虧則火旺，火旺也可煎熬脈絡而致瘀；血瘀又可阻礙氣機，進而濕蘊成痰。瘀血、痰濕、郁火既是病理產物，又是致病因素。目前中醫藥在治療AMD的進程中做出了有益的探索，并取得了一定的臨床效果，研究表明枸杞子防治眼病療效顯著，是作為防治AMD的首選藥[6]。枸杞子性平，味甘，入肝經、腎經、肺經，中醫認為它有補腎、滋陰、益精、養血，養肝，明目等功效。枸杞多糖是枸杞子主要的生物活性成分，現代藥理實驗表明，枸杞多糖具有免疫調節、抗衰老、防輻射、抗疲勞、保護生殖系統、抗缺氧等多種功效，這與其具有Glycan-O-Ser結構的糖綴合物—枸杞糖肽(LbGP)密切相關[7]。枸杞糖肽(LbGP)是從 枸杞多糖中分離純化得到一種有免疫活性的糖蛋白，分子量為 88 ku，糖含量為70 %，LbGP中含有天然氨基酸，其中Ser含量最高，后續又分離、純化得到5個糖綴合物LbGP l一LbGP 5，均具有較強的細胞免疫功能及抗氧化作用[8]。目前對枸杞糖肽功能的研究報道較少：枸杞糖肽能減輕缺氧誘導的心肌細胞鈣超載以及對缺氧心肌有明顯的保護作用[9]；枸杞糖肽對壓力應激導致中樞神經系統的炎癥反應具有免疫調節效果[10]；枸杞糖肽可提高rd10小鼠視網膜感光細胞的存活率[11]。枸杞多糖的提取率受提取溫度、次數、料液比、時間等因素的影響[12]，王杉杉等[13]采用正交試驗優化提取條件，枸杞多糖平均得率58.91%；李玲梅等[14]采用的超聲法枸杞多糖提取率為86.98%，隨著枸杞多糖提取工藝的更新和提高，枸杞子的資源化利用將會更加廣泛。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，由多種基因調控的主動的、程序化的死亡過程。近年來大量的實驗研究表明，線粒體通路在細胞凋亡中起著關鍵性作用[15]，在眾多的凋亡基因中Bcl-2蛋白家族和Caspase家族是當前最受關注的研討論點。其中Bcl-2和Bax是一對拮抗基因，Bcl-2是抑制細胞凋亡因子，Bax則屬于促凋亡因子，研究發現Bcl-2的過度表達可與Bax形成異源二聚體而抑制細胞凋亡[16]，Bcl-2/Bax比值是決定對細胞凋亡抑制作用的關鍵因素，隨著Bcl-2/Bax比值降低，細胞凋亡率明顯升高；反之，細胞存活率顯著升高[17]。Caspase-3是Caspase家族目前已知最關鍵的凋亡執行蛋白酶[18]。Caspase-9是細胞凋亡的標志性蛋白，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，而活化后的Caspase-3可特異性的水解細胞內各種底物，從而啟動細胞凋亡級聯反應，使細胞形成凋亡小體，進而導致細胞凋亡[19]。Bcl-2家族參與線粒體凋亡通路，使線粒體膜損傷，細胞色素CytC釋放到胞質，當細胞發生凋亡時，Caspase-3 家族在細胞凋亡機制中與凋亡蛋白酶激活因子-1、Procaspase-9形成凋亡復合體，激活Caspase-9，進一步激活Caspase-3從而啟動細胞凋亡[20-21]。

本研究結果顯示：提升枸杞多糖的純度后，其Caspase-3、Caspase-9、bax蛋白的表達水平得到了明顯抑制，而Bcl-2/Bax比值、Bcl-2的蛋白水平升高，這些結果提示枸杞子對RPE細胞的保護作用可能與線粒體介導凋亡信號通路有密切的聯系。枸杞多糖純度的提升可降低RPE細胞凋亡率，高、低純度組的比較，表明其保護作用具有一定的差異性[22]，隨著其純度的升高，枸杞多糖相對分子含量就越高，使得藥物療效進一步提高。

綜上所述，LBP對光誘導的ARPE-19 細胞損傷具有一定的保護作用，采用提升枸杞多糖純度的方法，有助于降低細胞凋亡率，提升保護效果，由于本實驗條件有限，未能選用更高純度的枸杞多糖，因此對其保護作用的差異性需待進一步研究證實。