耙耙柑果酒發酵工藝研究

劉 建，吳華昌，鄧 靜，劉 陽

（1.仲愷農業工程學院，廣東廣州 510230；2.四川旅游學院，四川成都 610199）

耙柑學名春見柑橘，品皮薄，果皮與肉質分離。川渝地區俗稱“軟”為“耙”，故稱耙耙柑，其果肉為橙色，肉質脆嫩、多汁、囊壁薄、化渣，糖度高，風味濃郁，清甜，少籽與無籽。柑橘果肉中含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素等多種健康因子，耙耙柑含糖在14 %以上，酸度為1 %左右，油富含人體所需的維C、鐵、鈣、磷、檸檬酸、維生素C、胡蘿卜素等，可溶性固形物14.5%，具有止咳化痰、潤腸去火、排毒養顏、疏肝健脾等多重功效。

耙耙柑作為四川特色水果，種植面積和種植量較大，但由于季節性成熟，耙耙柑滯銷嚴重，導致耙耙柑資源浪費嚴重。因此，本研究旨在利用耙耙柑發酵制作成果酒，既能增強口感，降低酒精度，滿足營養需求，又能增加耙耙柑加工途徑，豐富耙耙柑加工產品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原料耗材及試劑

耙耙柑，產地為四川眉山；果膠酶，柚苷酶，蔗糖，活性炭，檸檬酸，氫氧化鈉，酚酞指示液，葡萄糖，購于成都金山化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器設備

BT42 超純水機，上海睿析科學儀器有限公司；QYC-2102C 型恒溫培養箱，上海福瑪實驗設備有限公司；EK328 香山電子稱，廣東山衡器集團股份有限公司；CJJ0003 電磁攪拌器，金壇新瑞有限公司；LC20012598 手持酸度計，上海力辰有限公司；H032333糖度儀，北京元速動力科技有限公司；ZL-511ATC 手持酒精折光儀，四川中浪科技有限公司；京制00000113 號紫外可見分光廣度計，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

耙耙柑→去皮核→榨汁→酶解→過濾→脫苦→裝瓶→發酵→取液→滅菌裝瓶

1.2.2 操作要點

原料的選取和處理：選用新鮮飽滿成熟的耙耙柑，人工剝皮，盡量去掉白色橘絡，以防止苦味物質的增加。耙耙柑榨汁前加入0.1 %的檸檬酸，防止耙耙柑汁液變色。酶解時加入0.2%的果膠酶攪拌均勻，在燒杯口蓋上保鮮膜，放入45 ℃的水浴鍋內靜置1 h。酶解后加入0.12 %的柚苷酶攪拌均勻，在燒杯口蓋上保鮮膜，放入50 ℃的水浴鍋內靜置2 h。在發酵前，加入適量的蔗糖，調節糖度為一定值，再加入0.03 %活化好的干酵母，攪拌均勻。最后放入恒溫箱內，調制一定的溫度，進行發酵。

1.2.3 前處理優化工藝

目前柑橘果酒產業化加工較少，主要原因是柑橘加工后會產生苦味。這類苦味物質嚴重影響了柑橘果酒的口感,給消費者帶來不愉快的體驗，對感官評分產生影響。榨汁后加入果膠酶，用柚苷酶或活性炭對果汁進行脫苦，以感官評定為依據判定最佳的果膠酶用量和脫苦方式。

1.2.4 發酵工藝條件單因素實驗

初始發酵條件：12 %蔗糖添加量，0.02 %酵母添加量，24 ℃發酵溫度，6 d 發酵天數，改變其中一個因素，固定其他工藝參數，最終以酒精度、感官評分、透光率、可溶性固形物、糖酸比、pH 值等數據進行結果分析。其中發酵天數設置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d 共5 個梯度；糖度梯度設置4 %、8 %、12 %、16 %、20 %共5 個梯度，酵母量添加量0.01 %、0.02 %、0.03 %、0.04 %、0.05 %共5 個梯度；發酵溫度設置22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃共5 個梯度。

1.2.5 感官指標

選十位經過感官培訓的專業感官評價人員對果酒進行評分，鑒評人員按照表1 的感官評分標準對樣品進行獨立評分并記錄。

表1 感官評價標準

1.2.6 評定指標測量方法

酒精度：酒精度折光儀檢測。

總糖的測定：按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規定測定。

透光率的測定：利用紫外可見分光光度計選擇透光率，波長設定為680 nm進行測定。

1.2.7 發酵工藝優化

在單因素試驗結果基礎上，選擇以發酵溫度（A）、發酵時間（B）、初始加糖量（C）和酵母接種量（D）為自變量，以耙耙柑果酒的酒精度（Y）、感官評分（Y）為響應值，采用響應面法進行優化，篩選出果酒的最佳發酵工藝條件。

2 結果與分析

2.1 發酵前處理優化

2.1.1 果膠酶酶解用量的優化

當不添加果膠酶時，耙耙柑果汁渾濁，含有大量的上層不溶性沉淀，影響果酒酒體的外觀。隨著果膠酶添加量的增加，果膠酶能分解細胞內的果膠質，液體逐漸澄清透明，上層的不溶性沉淀減少，有明顯的分層現象，有益于后期的過濾，增加出汁率。當果膠酶添加量為0.3 %時，果汁變得澄清透明，分層明顯，因此選擇果膠酶含量在0.3 %最為合適。

2.1.2 脫苦方式的選擇

耙耙柑在加工生產的時候會出現苦味物質加重的情況，這也是制作產品時一個比較重要的問題。新鮮成熟的耙耙柑鮮食并無明顯苦味，工業榨汁后，釋放出了柚體或者果皮內的苦味物質，使其帶有大多數人無法接受的苦味。通過查找資料得知，主要的苦味物質為檸檬苦素和柚皮苷等物質，除掉其中的苦味物質，常用方法為吸附法和酶解法等。本實驗分別比較了物理法脫苦和酶法脫苦，實驗材料分別為活性炭和柚苷酶，通過感官評價比較，酶法脫苦優于物理脫苦，所以脫苦方式選擇酶法脫苦。

表2 果膠酶用量對耙耙柑果酒的影響

表3 脫苦方法的比較

2.2 發酵時間對耙耙柑果酒品質的影響

由表4可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著發酵時間的延長均在下降，發酵時料液中的酵母菌將糖轉化為酒精，可溶性固形物和總糖被消耗，同時料液中的微生物也在產酸。發酵時間越長酒體越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是評價發酵時間最重要的指標，如圖1所示。

表4 發酵時間對各項理化指標及感官評分的影響

圖1 發酵時間對耙耙柑果酒品質的影響

酒體的酒精度、主體風味及色澤的形成主要是在主發酵階段。由圖1 可以看出，2～6 d 發酵時，感官評分較低，酒精度數一直在上升，發酵天數不足還未發酵徹底；隨著發酵天數的增加，耙耙柑果酒的酒精度以類似直線的增長率持續上升，可能是酵母一直在發酵，即便酒精度的增加會抑制酵母的發酵，但不會完全抑制，還是會有一部分酵母產出乙醇。發酵天數為6 d 時，耙耙柑果酒的感官評分最高，此時產品的品質最好，并且酒精度也控制在一個合理的量，果酒的口感最好。隨著發酵天數的增加，在6～10 d 風味逐漸下降，可能是出現了輕微的酸敗現象，抑制了果酒酵母產生酒精的能力，并且產酸使果酒感官品質大大降低。綜合考慮選擇6 d 為最佳發酵時間，同時發酵時間對整個發酵過程影響并不明顯，所以不作為響應面因素。

2.3 發酵溫度對耙耙柑果酒品質的影響

由表5 可知，糖酸比、可溶性固形物、總酸，隨著發酵溫度的升高均在下降，發酵時料液中的酵母菌因為溫度升高將料液中的糖轉化為酒精的速率增加，可溶性固形物和總糖被消耗速率加快，料液中的微生物產酸速率也加快。發酵溫度越高酒體越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是評價發酵溫度最重要的指標，如圖2所示。

表5 發酵溫度對各項理化指標及感官評分的影響

圖2 不同發酵溫度對耙耙柑果酒品質的影響

酵母菌之所以能夠正常繁殖生長發酵，適當的溫度起著很大的作用。溫度太低，酵母幾乎不會發芽或者以十分緩慢的速度發芽繁殖；在適應的溫度范圍內，酵母能夠快速的發芽繁殖到最高細胞數，并且充分的進行發酵。由圖2 可以看出，發酵溫度對耙耙柑果酒酒精度和感官品質的影響較顯著。當發酵溫度為21～24 ℃時，果酒的品質隨酒精度的上升而上升；24 ℃時果酒品質、酒精度達到較好水平；24 ℃時酒精度的增長速度最快，但24～33 ℃品質開始下降，可能是過低和過高的溫度，酵母的發酵減緩，低溫抑制酵母發芽數，高溫抑制酵母發酵。綜合考慮選擇24 ℃為最佳發酵溫度。

2.4 酵母接種量對耙耙柑果酒品質的影響

由表6可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著酵母接種量的增加均在增加。發酵時料液中的酵母菌接種量增加，料液中的糖轉化為酒精速率也增加，可溶性固形物和總糖被消耗速率加快，料液中的微生物產酸速率也加快。酵母接種量在0.03 %時透光率最高。酒精度和感官是評價酵母接種量最重要的指標，如圖3所示。

表6 酵母接種量對各項理化指標及感官評分的影響

圖3 酵母接種量對耙耙柑果酒品質的影響

由圖3 可知，耙耙柑果酒的酒精度和感官評分都有明顯變化。在酵母接種量0.01 %時酒精度和感官評分都最低，說明此時酵母接種量過少發酵未徹底，酒精度和果酒品質偏低；隨著酵母接種量的增加，在0.02 %時果酒品質最好；繼續增加酵母接種量，酒溶液中含糖量下降，酸度上升，可能是接種密度過大，導致發酵液中溶氧不足，抑制了酵母的生長，不利于香氣物質的形成，口感變差。添加0.03%酵母接種量時酒精度為最高，隨著添加量的增加酒精度減少，此時發酵液中糖含量最低，無法被酵母轉化成酒精。綜合考慮選擇0.02 %酵母接種量為最適酵母接種量。

2.5 初始加糖量對耙耙柑果酒品質的影響

由表7可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著糖度的增加均在增加。發酵時料液中初始加糖量增加，料液中更多的糖能轉化為酒精，酒精度也更高，可溶性固形物和總糖在發酵完成后殘留量也更多，料液中的微生物產酸速率也加快。初始加糖量在12%時透光率最高。酒精度和感官是評價初始加糖量最重要的指標，如圖4所示。

表7 初始加糖量對各項理化指標及感官評分的影響

圖4 不同初始加糖量對耙耙柑果酒品質的影響

不同的初始加糖量會影響耙耙柑果酒的發酵和酒精度的含量，適當濃度可以增強酵母的發酵，使果酒的風味更好，結果見圖4。由圖4 可知，初始加糖量對耙耙柑果酒的酒精度和品質有明顯的影響，總體呈現上升的趨勢。在初始濃度為12%時，耙耙柑果酒的品質達到最高值，酒精度也相對平穩。繼續增加糖度，酒精度越來越高，高濃度的糖分和酒精度會抑制耙耙柑果酒酵母的發酵作用，并且過高的酒精度會影響果酒的風味。因此，在12%～20%的糖度下，酒精度明顯加強，但果酒最終的品質下降。因此調節耙耙柑汁的最佳糖度為12%。

2.6 發酵工藝優化

根據據單因素試驗得出的結果，最佳發酵工藝條件為發酵時間6 d，發酵溫度24 ℃，酵母接種量0.02%，初始加糖量12%。由于發酵時間對發酵結果影響不明顯，所以根據單因素試驗結果以酵母添加量（A），初始加糖量（B）及發酵溫度（C）為影響因素，以酒精度（Y）和感官評分（Y）為響應值，利用DesignExpert8.06 響應面軟件的Box-Behnken 試驗設計3因素3水平試驗，見表8。

表8 Box-Behnken試驗設計因素與水平

試驗設計結果與分析見表9，方差分析結果見表10、表11。對獲得的數據利用分析軟件Design-Expert 進行多元回歸方程擬合，得酒精度（Y）和感官評分（Y）二次多項回歸模型方程為：

表9 Box-Behnken試驗設計結果與分析

由表10 和表11 回歸模型方差分析結果可知，以響應面法建立的二次回歸模型方程，兩個模型都為極顯著（P＜0.01），而且失擬項都為不顯著（P＞0.05），未知因素對試驗結果干擾不大。酒精度和感官評分的校正決定系數R為97.04%和99.29%，說明該模型的擬合程度比較好，采用響應曲面法優化建立的耙耙柑發酵工藝回歸方程（模型）是有效的，可以用來確定耙耙柑發酵果酒釀造的最佳發酵工藝。以酒精度（Y）為響應值時，一次項C 和交互項AB 影響顯著，A、A、B、C影響都為極顯著，由F檢驗可以得到的因子貢獻率為A＞C＞B；以感官評分(Y)為響應值時，一次項C、交互項AB、AC、BC 和二次項A、B、C影響極顯著，由F 檢驗可以得到因子貢獻率為C＞B＞A。

表10 回歸模型方差分析

表11 回歸模型方差分析

各因素對指標影響的響應面及等高線結果見圖5。由圖5 可知，在Y模型中BC、AC 交互作用不顯著，所以對AB 交互作用進行分析，在保持發酵溫度恒定的情況下，酒樣品中的酒精含量首先增加，隨著初始糖含量和酵母數量的增加而降低，且所述等高線為橢圓形，具有極端值，彎曲表面是相對陡峭的，交互顯著。在Y模型中等高線最小橢圓的中心點為響應面的最高點，即感官評分最高，等高線的形狀為橢圓形，曲面傾斜度越高，坡度越陡，各因素對感官評分的影響越顯著，說明AC、BC、AB 交互作用顯著。使用響應面優化分析方法分析回歸模型，選擇酒精含量和感官評分的重要性為5，分別選擇酒精含量和感官評分的最大響應值。尋找最優響應結果為酵母添加量0.022 %，初始加糖量12.20%，發酵溫度23.95℃。此優化條件下發酵后果酒酒精度預測值為11.22%vol，感官評分預測值為83.27 分。為驗證試驗結果的真實性，考慮實際的操作情況，將發酵工藝參數調整為酵母添加量0.02%，初始加糖量12 %，發酵溫度24 ℃。在此發酵工藝條件下，進行6 次驗證試驗，耙耙柑果酒的感官評分實際值為80.25 分，酒精度實際值為11.05 %vol，與預測值相差較小，證明該回歸模型可行，應用響應面得出的最佳耙耙柑果酒發酵工藝可行。

圖5 初始加糖量、酵母接種量、發酵溫度交互作用對耙耙柑果酒感官評分和酒精度的響應面及等高線圖

2.7 耙耙柑果酒的最佳工藝品質

通過單因素試驗和響應面試驗對耙耙柑果酒發酵工藝進行優化處理，最終得到產品的感官指標：澄清透亮、有光澤、橙黃色，香氣協調、優雅，具有明顯的柑橘果香與酒香，酒體豐滿，醇厚協調，舒服爽口，回味延綿，有柑橘的風格，典型性良好。理化數據見表12。

表12 耙耙柑果酒理化指標

3 結論

以耙耙柑為主要原料，經過榨汁、酶解、脫苦、發酵等步驟制作成耙耙柑果酒，前處理優化使用柚苷酶脫苦。單因素實驗中，保持其他因素不變，最終得出調節耙耙柑汁的最佳糖度為12 %，最佳的發酵時間6 d，酵母量添加在0.02%為最佳，最佳發酵溫度為24 ℃；根據單因素試驗結果進行響應面試驗得出最佳發酵工藝：酵母量0.02 %、初始加糖量12%、發酵天數6 d、發酵溫度24 ℃下，果酒的品質最好。通過本研究，為耙耙柑果酒的工業化生產奠定了一定基礎。