中偏高溫機制與人工大曲主要生物理化指標比較研究

劉 超，何 平，羅明有，王 松，周瑞平，劉 江，付雨晴，胡 斌，張 玉，唐代云

（1.四川省宜賓市敘府酒業股份有限公司，四川宜賓 644600；2.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644600；3.四川輕化工大學，四川宜賓 644600）

大曲是賦予白酒風味的糖化劑和發酵劑，根據大曲不同的制曲頂溫可將其分為三類，分別是高溫大曲、中溫大曲、低溫大曲，其中高溫大曲主要運用于醬香酒生產，中溫大曲用于濃香酒的生產，低溫大曲用于清香型白酒生產。中溫大曲發酵頂溫一般在50～60 ℃，不同大曲原料和工藝參數略有不同，但步驟基本相同，中溫曲的制作主要分為原料的粉碎、成型、培菌、入庫儲存、使用等幾個階段。

在對中溫曲的研究中，胡曉龍等基于高通量測序對中溫大曲曲皮和曲心微生物群落結構進行解析，表明曲皮中真菌群落多樣性和豐度均高于曲心樣品，曲心中細菌群落多樣性高于曲皮，豐度低于曲皮；唐賢華運用PCR-DGGE 技術探究不同發酵期與貯存期的中溫大曲微生物群落結構，結果顯示，發酵4～8 d 微生物數量達到頂峰，儲存期微生物種類基本穩定，數量變化較大。

伴隨著白酒產量的不斷提升，對大曲的需求量也越來越大，傳統人工踩制已無法滿足需求。20世紀70 年代我國各大中型酒廠開始逐步試驗使用大曲壓塊機，機制曲在行業的使用比例日漸提高，但質量與傳統人工曲相比還存在一定差異。林培等研究人工踩制和機械壓制對大曲的影響，人工曲在香氣程度、斷面整齊度、皮張厚度等方面均優于機械曲；人工大曲的水分、酸度、糖化力、液化力略高于機制大曲，機制曲高級醇、醛類物質遠低于人工曲；傳統曲的細菌種類較機械曲少，真菌種類則比機械曲更為豐富。Wang 等基于高通量測序也研究了傳統和機械大曲的微生物群落結構。本研究利用高通量測序技術結合理化檢測對人工與機制中溫大曲的微生物群落結構和理化差異進行分析比較，意在找出二者理化與微生物差異的原因，為改善大曲的品質提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：取夏季生產儲存6 個月達到使用條件的機制曲和人工曲各20 塊，粉碎后混合均勻再各取200 g 裝進無菌密封袋，人工曲標記為DQ01，機制曲標記為DQ02，每個樣品取3 個平行樣，高通量試樣保存于-20 ℃冰箱等待DNA提取。

試劑及耗材：酚酞指示劑、95 %乙醇、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、冰醋酸、乙酸鈉、葡萄糖、硫酸銅、丙三醇、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸、鹽酸，成都市科龍化工試劑廠。

儀器設備：烘箱；電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；Pico-21 臺式離心機，Thermo Fisher 公司；GL-88B 漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；Biodoc-IT凝膠成像系統，美國UVP公司；Qubit?3.0 熒光計，Invitrogen 公司；T100PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

具體提取步驟參照OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒使用說明書（網址鏈接：http://omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/）。

1.2.2 PCR 擴增

細菌基因PCR 擴增所用引物采用Miseq 測序平臺的V3—V4通用引物。

338F 引 物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′。

806R 引 物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

真菌基因PCR所用引物為ITS1-2通用引物。

ITS1F 引物：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。

ITS2R 引物：5′GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

真菌、細菌PCR 條件均為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25次循環后，72 ℃延伸5 min，10 ℃保持至停止。PCR 擴增后，產物用2 %瓊脂糖進行電泳檢測，回收產物再用Qubit3.0 試劑盒進行精確定量，最后在Miseq平臺完成測序。

1.2.3 大曲理化指標的測定方法

大曲理化指標檢測參考Q/WLYJ07.05LHY。

1.2.4 數據統計分析

測序數據使用R 語言制作Venn 圖、稀釋曲線圖及優勢門、屬的堆疊柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 理化指標檢測（表1）

表1 大曲理化指標

由表1 可知，機制曲酸度、發酵力較人工曲高，水分、糖化力、液化力比人工曲低，可能是制曲時機制曲的提漿效果不如人工曲，使得其發酵初期升溫快、濕度高，有利于細菌生長代謝，從而產生更多的酸類物質，但后期儲存的過程中保水能力差，不利于微生物的生長，尤其是霉菌，霉菌是產糖化酶、液化酶的主要菌種，導致機制曲糖化力、液化力稍低于人工曲。機制曲酸度更大的環境適于酵母的生長，讓酵母成為了相對的優勢菌種，體現在大曲指標上就是機制曲擁有更高的發酵力。

2.2 Alpha多樣性分析（表2）

表2 為不同制曲方式大曲的真菌和細菌Alpha多樣性指數，在97 %一致性的水平上完成樣品的Alpha 多樣性指數分析。Coverage 值為樣本序列的覆蓋率，Coverage 值的大小和樣本中物種被檢測出來的幾率成正比，樣本檢測顯示Coverage 數值達到0.99，即認為本次測序結果可以代表樣本的真實情況，達到準確反映細菌、真菌群落的種類及結構的要求。在不同制曲方式中溫大曲中，人工曲DQ01樣品真菌的Ace、Chao1、Shannon 指數均高于機械曲DQ02，而Simpson 指數低于DQ02，說明人工曲檢出真菌物種總數較多且分布均勻；DQ01 細菌的Ace、Chao1 指數均低于DQ02，說明DQ02 細菌群落較DQ01 更為豐富。結合理化初步分析造成機制曲與人工曲細菌和真菌豐富度和多樣性差異的原因為機制曲壓曲較為緊實，水分揮發較慢，發酵初期溫度高、濕度高、厭氧的環境給細菌生長繁殖創造了有利條件，人工曲更為疏松，水分及時揮發有利于真菌的生長。

表2 Alpha多樣性分布表

圖1（A）直觀反映了不同制曲方式大曲樣品中細菌共有的OTU 及特有的OTU，由圖1（A）可知，機械和人工曲樣品中細菌共同的OTU 有52 個，機械曲特有的OTU 為11 個，人工曲特有OTU 僅為2個；由圖1（B）可知，在真菌方面共有的OTU 有32個，機械曲特有OTU 為2 個，人工曲特有OTU 為6個。說明機制曲在細菌方面多樣性更好，人工曲的真菌多樣性更豐富，可以反映出兩者理化存在差異，機制曲更適合細菌生長。

圖1 細菌和真菌在屬水平韋恩圖

2.3 微生物群落結構分析

根據測序結果首先在門水平上對樣品數據進行分析，由圖2（A）可知，DQ01 中細菌在門水平上檢出相對豐度前5的分別是變形菌門Proteobacteria(70.35 %)、厚壁菌門Firmicutes(12.01 %)、藍藻門Cyanobacteria_Chloroplast(8.82 %)、未分類的細菌門unclassified_Bacteria(7.85%)、其他Other(0.97%)，DQ02 在門水平上檢出的豐富度前4 依次是變形菌門Proteobacteria(87.38 %)、厚壁菌門Firmicutes(9.37 %)、藍藻菌門Cyanobacteria _ Chloroplast(1.51 %)、其他Other(1.74 %)。不管是機械還是人工曲變形菌門和厚壁菌門都是優勢門，機械曲中兩者的相對豐度更是達到了96.75 %，兩者的優勢地位與Zhang等對清香型大曲細菌組成及多樣性研究基本相似，制曲溫度不同兩者在豐富度上也各有差異，樊建輝研究陶香型大曲也證實厚壁菌門為優勢菌門，其次為變形菌門，王曉丹用高通量測序對醬香大曲進行研究，檢出的細菌門主要為厚壁菌門、變形菌門等，即在門水平上機械與人工曲細菌的多樣性較為相似，但藍藻菌門相對豐度僅為人工曲的1/8 左右，可能是機制曲水分含量低不適于藍藻菌門生長繁殖。真菌方面DQ01 門水平上豐富度前4 的依次為毛霉門Mucoromycota(52.53%)、子囊菌門Ascomycota(43.78 %)、未分類的unclassified(3.05%)、其他Other(0.64%)，DQ02 檢測出子囊菌門Ascomycota(91.65 %)、毛霉門Mucoromycota(6.71 %)、未分類的unclassified(1.54 %)、其他Other(0.1 %)。可以發現子囊菌門和毛霉門占據菌群的絕大部分相對豐度，郭敏對傳統與機械醬香大曲制曲過程中的微生物進行研究，顯示子囊菌門在入房、一翻、二翻、出房中均為第一大優勢門，前三階段相對豐度超99%，李申奧對兼香高溫大曲的研究及Hu對白云邊大曲的研究同樣得出子囊菌門為最優勢菌門。DQ02 中子囊菌門與毛霉門相對豐度差值達84.94 %，造成二者差異的原因可能為機制曲緊實且翻曲次數少，發酵溫度高不利于毛霉門菌類的生長。

圖2 門水平的群落結構分析圖

圖3 屬水平的群落結構分析圖

屬水平結果顯示，人工曲細菌屬相對豐度情況為未分類腸桿菌屬unclassified_ Enterobacteriaceae(68.84%)、鏈球菌屬(8.82%)、未分類細菌屬unclassified_Bacteria(7.85 %)、Other(3.7 %)、葡萄球菌屬(3.5 %)、魏斯氏菌屬(2.48 %)、片球菌屬(2.24 %)、乳桿菌屬(1.56 %)、芽孢桿菌屬(1.02 %)，機械曲細菌屬相對豐度為不動桿菌屬(80.52 %)、其他Other(5.26 %)、未分類腸桿菌屬unclassified_Enterobacteriaceae(3.49 %)、乳桿菌屬(2.44 %)、假單胞菌屬(1.91%)、片球菌屬(1.87%)、魏斯氏菌屬(1.68 %)、(1.51 %)、高溫放線菌屬(1.33%)。

人工曲中腸桿菌屬和鏈球菌屬占據相對豐度優勢，劉雄對中、高溫大曲固態發酵過程微生物菌群結構變化的研究表明腸桿菌屬和鏈球菌屬在中、高溫曲中為優勢菌種，發酵結束時腸桿菌屬在中、高溫曲中相對豐度分別為77 %、83 %，機制曲中不動桿菌屬為絕對優勢菌種。資料顯示，腸桿菌屬一條代謝路徑的主要終產物為混合有機酸，包括琥珀酸、乳酸、乙酸和甲酸，另一代謝路徑的主要產物為中性溶劑，包括乙醇和丁二醇，腸桿菌屬在紅腐乳后酵期發酵過程中還與賴氨酸、苯丙氨酸等大部分氨基酸呈顯著正相關，促進腐乳中氨基酸濃度的升高；不動桿菌屬因其含有豐富的酯水解酶，能促進辛酸乙酯的合成，與以辛酸乙酯為主酯類的風味化合物呈正相關，據報道不動桿菌屬還與制曲過程中吡嗪類物質的合成有關；葡萄球菌屬可以產生3-甲基-1-丁醇和乙偶姻等風味物質，成為白酒風味物質的前體；乳桿菌屬與魏斯氏菌屬具備代謝產生乙酸、乳酸等有機酸的能力，這些酸是白酒中重要的風味成分；魏斯氏菌屬還具有一定耐酸性，能分解葡萄糖產二氧化碳；高溫放線菌屬耐高溫、生長快、可產蛋白酶及纖維素酶，酶在較高溫度下仍能保持酶活及穩定性，是白酒風味物質的重要來源；芽孢桿菌有較強的蛋白和淀粉分解能力，為美拉德反應初期生成阿馬多利化合物提供充足的原料，為提升酒質的重要菌種。

人工曲真菌屬相對豐度前9 為毛霉屬(36.05%)、伊薩酵母屬(18.41%)、根霉屬(15.77 %)、曲霉屬(7.81 %)、其他Other(6.87 %)、假絲酵母屬(5.4 %)、芽生葡萄孢酵母屬(3.4 %)、嗜熱真菌屬(3.26 %)、未分類真菌屬unclassified(3.05 %)，機械曲為伊薩酵母屬(71.36 %)、嗜熱真菌屬(11.02 %)、毛霉屬(6.37 %)、其他Other(4.63 %)、孢圓酵母屬(3.25%)、生絲畢赤酵母屬(1.81 %)、未分類真菌屬unclassified(1.54 %)，人工曲霉菌屬的相對豐度占總豐度約60%，酵母屬占總豐度約30%，機制曲酵母的相對豐度約80 %，其余僅剩少量的嗜熱真菌及霉菌。液化酶、糖化酶、酯化酶、纖維素酶、果膠酶等主要來源于霉菌，霉菌降解淀粉產生葡萄糖供其他微生物利用，是白酒釀造中的動力源泉。根霉在大曲發酵過程中菌絲體生長至曲醅內部，分泌各種酶到曲醅環境中促進曲的成熟，也具有產乙醇、甲基丁酮等風味物質的能力；毛霉屬作為大曲中極為重要的霉菌，主要富集于制曲的低溫培菌期，能分泌蛋白酶促進曲的分解；曲霉主要分泌酸性水解酶，例如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，這些酶具有耐乙醇、耐酸的特性，使其能夠在酸性發酵條件下酶解原料中的淀粉和蛋白質，為發酵提供動力，牟穰等研究黃酒生產過程中微生物及風味的關聯顯示，曲霉屬與異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯等風味物質有關；伊薩酵母屬是一種廣泛存在于釀酒生產中、能夠產生乙醇的酵母屬，具有耐熱性好、耐酒精能力強和乙酸乙酯產生量高，產異戊醇和正丙醇能力比釀酒酵母低2～3倍的特點；假絲酵母屬在大曲發酵過程中是非常重要的真菌，產酒精以及酯類物質，如異戊酸、苯乙醛、辛酸乙酯等，也可產生酚類、酮類和烯類等揮發性香味化合物，對大曲質量起到積極的影響。譚崇堯研究不同地域濃香型大曲微生物結構得出：不論是北方派、長江中游派、江淮派、川派，嗜熱真菌屬為共有的優勢真菌；孫利林分析了不同廠醬香大曲的微生物菌群結構以及楊少勇對襄陽地區高溫大曲和中高溫大曲真菌多樣性解析也都表明嗜熱真菌屬為優勢真菌，說明嗜熱真菌屬基本沒有地域差異。機制與人工曲兩者真菌相對豐度不同主要由機制曲前期升溫較快較高，后期水分較少造成。

為探究機械和人工大曲樣品在類群上的相似性程度，從制曲方式物種兩個層面進行了聚類分析，并繪制出相對豐度聚類熱圖，更加直觀的體現大曲樣品細菌及真菌屬在組間豐度和樣本間多樣性的異同，顏色深淺代表的是物種豐度。由圖4 可知，橫向聚類分析結果顯示DQ01 與DQ02 不管在細菌還是真菌屬上均可分為一類，縱向表示不同物種在制曲方式間豐度的相似性情況。細菌聚類熱圖分析結果顯示，和unclassified_Enterobacteriaceae豐度相似性較大，和物種豐度相似性較大，和豐度相似性好；真菌聚類熱圖結果顯示，和、和、與的豐度相似性好。

圖4 微生物群落聚類樹形圖

3 結論

本研究以存儲6 個月機制曲和人工曲為研究對象，采用高通量測序技術對兩者的微生物群落結構和多樣性進行分析，并輔以理化檢測，結果表明：在細菌屬中，人工曲以腸桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬為主；機制曲以不動桿菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、高溫放線菌屬為主；在真菌屬中，人工曲優勢菌種為毛霉屬、伊薩酵母屬、根霉屬、曲霉屬、假絲酵母屬、芽生葡萄孢酵母屬、嗜熱真菌屬；機制曲則為伊薩酵母屬、嗜熱真菌屬、毛霉屬、孢圓酵母屬、生絲畢赤酵母屬。機制曲酸度、發酵力較人工曲高，糖化力、液化力較人工曲低，導致兩者微生物及理化差異的主要原因可能是機制曲緊實度與水分含量高、提漿效果較差，發酵初期高溫高濕厭氧的條件利于細菌生長，產酸類物質多，且不利產糖化酶、液化酶的霉菌生長，這也與測序結果相印證，機制曲細菌多樣性較好，真菌多樣性差，豐富度集中在少數菌種上，而人工曲剛好相反，細菌多樣性較差，真菌多樣性較好，豐富度在每個菌種上分布均勻。對機制和人工曲微生物群落結構及多樣性差異的后續研究還需在考慮生長環境的基礎上結合轉錄組學、代謝組學以及蛋白質組學開展。本研究為了解采用不同制曲方式的大曲微生物群落結構的差異提供了基礎數據，同時對改進制曲工藝，針對不同制曲方式“對癥下藥”有極大幫助。