濃香型白酒正丁醇生成規律及代謝途徑的研究

孔小勇，曹永楠

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

正丁醇是濃香型白酒重要的芳香組分和呈味物質，對窖香濃郁、綿厚味長的風格形成和舒適的飲用體驗起到重要作用。濃香型白酒中正丁醇含量在5～50 mg/100 mL，高于其他香型白酒，適量的正丁醇可提高白酒的濃厚感并增加協調性，但含量過高會帶來味苦微澀、醉酒上頭等不良飲用體驗。

當前研究表明，正丁醇的生成與梭菌的物質代謝有關。窖池作為濃香型白酒的發酵容器，棲息著種類豐富、數量眾多的梭菌，是各類微生物進行一系列生化反應的重要場所。窖泥中某些梭菌屬微生物利用含淀粉、纖維素或糖類物質的谷物原料作為主要碳源和能量來源，代謝生成正丁醇。本研究通過采集窖內不同位置、發酵時間節點的酒醅，分析濃香型白酒發酵過程正丁醇的生成規律；篩選產正丁醇含量差異顯著的窖泥進行微生物分離，分析產正丁醇的主要微生物的種類及能力；跟蹤比較不同生產排次、釀酒車間的生產情況，梳理出影響正丁醇生成的主要工藝因素，為調控酒中正丁醇含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

窖泥和酒醅：取自洋河酒廠各釀酒車間，窖泥和出入窖酒醅置于-80 ℃凍存，大曲室溫保存。

1.1.2 培養基

胰蛋白胨生理鹽水溶液：胰蛋白胨1 %，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，121 ℃滅菌15 min。

RCM 培養基：蛋白胨1%，牛肉浸粉1%，氯化鈉0.5 %，葡萄糖0.5 %，酵母浸粉0.3 %，可溶性淀粉0.1 %，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 %，121 ℃滅菌15 min。

P2發酵培養基：葡萄糖6%，酵母粉0.3%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.002%，七水硫酸亞鐵0.001 %，氯化鈉0.001 %，對氨基甲苯0.0001 %，維生素B1 0.0001 %，生物素0.0001 %，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

正丁醇標準品，美國Sigma-Aldrich 公司；基因組DNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.4 儀器設備

酒醅取樣器，自制；氣相色譜儀，日本島津公司；高效液相色譜(1200)，美國Agilent 公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海書俊儀器設備有限公司；恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；超低溫冰箱，上海躍進醫療器械廠；低溫冷凍離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司；超純水制備儀，美國賽默Thermo 公司；漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；pH計，上海儀邁儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒醅中正丁醇的測定

（1）提取條件：50 g 酒醅，17 %vol 乙醇溶劑體積150 mL，餾分體積15 mL。

（2）檢測條件：載氣N，流速1 mL/min，進樣口溫度270 ℃，進樣量1 μL，分流比50∶1，cpwax57CB 型（cp-97723A）毛細管色譜柱，50 m*0.25 mm*0.25 μm；程序升溫，35 ℃保持6 min，6 ℃/min 升溫至60 ℃，保留3 min，再以4.5 ℃/min升溫至80 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min升溫至180 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min 升溫至210 ℃，保留10 min；FID檢測器，300 ℃，H30 mL/min，空氣300 mL/min。

1.2.2 產正丁醇微生物的分離純化與鑒定

（1）分離：稱取10 g 窖泥與100 mL TPS 緩沖液混合，80 ℃處理10 min 以殺死非芽孢狀態的菌體及其他營養細胞，室溫放置20 min 富集菌體，再置于80 ℃處理10 min，待冷卻至30～40 ℃時，以10 %的接種量轉移至乙酸鈉液體培養基，37 ℃厭氧富集培養7 d。取1 mL 菌液稀釋涂布于RCM 固體培養基，37 ℃厭氧培養2～5 d。觀察培養皿中微生物生長情況，挑取不同形態的菌落劃線分離3次及以上，得到菌株的純培養物。

（2）鑒定：使用DNA 提取試劑盒提取分離到的細菌基因組DNA，對獲得的總基因組DNA 進行16S rDNA 的PCR 擴增，將測序結果提交至Gen-Bank數據庫進行BLAST比對，鑒定種屬。

（3）產正丁醇能力評價：挑取單菌落接入RCM液體培養基，37 ℃靜置厭氧培養24 h，以10%接種量接種至P2 培養基，37 ℃厭氧發酵3 d，測定正丁醇含量。

2 結果與分析

2.1 濃香型白酒釀造過程正丁醇的變化規律

2.1.1 不同生產排次正丁醇變化規律

通過對比濃香生產全周期中4 個排次原酒正丁醇的變化（圖1），可知頭排酒發酵周期最長，達到150 d，原酒正丁醇含量相對最高，在超長期壓窖時期里，窖內進入以厭氧細菌生長代謝為主導的半固液態發酵階段，正丁醇含量不斷累積，為正丁醇的生成提供時間上的優勢。隨著排次流轉，原酒正丁醇逐漸降低，四排酒生產結束后再進入超長期壓窖，正丁醇升高，循環往復，規律明顯。

圖1 濃香工藝中不同排次原酒中正丁醇含量比較

2.1.2 窖內不同醅層正丁醇的分布

在酒醅發酵結束、出池環節采集窖內不同位置酒醅和黃水樣品，窖內自上而下依次是回缸醅、小米查醅、大米查醅、雙輪底。正丁醇含量檢測結果見圖2，不同位置的酒醅和黃水中正丁醇含量分布差異明顯，黃水中正丁醇含量最高，雙輪底長期與窖底泥接觸，浸沒在黃水之中，正丁醇含量僅次于黃水，大米查醅位于窖池中下層，正丁醇含量低于雙輪底，小米查醅位于窖池中上層，正丁醇含量最低，回缸醅位于窖內最上層，與封泥直接接觸，回缸醅中正丁醇含量高于大米查、低于雙輪底，介于兩者之間，窖內整體呈現“上下高、中間低”的規律，說明與窖泥充分接觸可促進正丁醇的生成。

圖2 窖內不同位置醅層正丁醇含量差異比較

以入池酒醅作為培養基，在培養箱內模擬發酵，對比有無窖泥參與發酵的情況下酒醅中正丁醇的含量，結果見圖3，在相同的培養條件下，有窖泥參與的模擬發酵酒醅中正丁醇含量均高于無窖泥參與的酒醅樣品，且隨著窖泥接種量的增加，酒醅中正丁醇含量也呈逐漸升高趨勢。綜上可知，窖泥是濃香型白酒中產正丁醇微生物的重要載體，這為后續篩選分離產正丁醇微生物的研究指明方向。

圖3 不同窖泥接種量下酒醅中正丁醇含量差異

2.1.3 窖內不同發酵時期正丁醇的生成規律

采集窖內不同位置、不同發酵時間節點酒醅進行正丁醇檢測，結果見圖4，大米查、小米查和回缸在入池環節正丁醇基本檢測不到；在入池14～21 d 之后，正丁醇呈快速增長趨勢。雙輪底因上一輪未蒸燒而直接入池，故正丁醇在初始階段含量高于其他醅層，隨著發酵的進行，正丁醇含量逐漸升高。可以得知各醅層中正丁醇含量變化趨勢基本一致，均是隨著發酵周期的延長而逐漸升高，這是因為在發酵的前14 d中，主要是大曲微生物（如芽孢桿菌、酵母、霉菌等好氧或兼性厭氧細菌）在有氧條件下進行淀粉質原料的糖化和蛋白質的水解，同時伴隨著氧氣的消耗；發酵14 d 后窖內氧氣基本消耗完畢，窖泥中的厭氧功能微生物逐漸活躍，正丁醇開始形成。隨著濃香抽黃水作業的進行，出池醅中正丁醇含量有所下降，黃水對酒醅中正丁醇有較好的洗脫效果。

圖4 窖內酒醅中正丁醇含量隨發酵周期的變化趨勢

2.2 正丁醇生成途徑的解析

2.2.1 窖泥中產正丁醇微生物的篩選分離

采用RCM 培養基從窖泥中共分離得到8 株梭菌，通過16S rRNA 序列比對鑒定分別為拜氏梭菌（）、楔形梭菌（）、巴布利丁酸梭菌）、腸梭菌（）、丁酸梭菌（）、預耳蝸梭菌（）、酪丁酸梭菌（）、第三梭菌（），采用P2 培養基考察上述8 株梭菌產正丁醇能力的差異，如表1 所示，其中產丁醇能力最強（1027.7 mg/100 mL），產丁醇能力最弱（14.2 mg/100 mL）。

表1 濃香型白酒窖泥中梭菌的分離與鑒定

2.2.2 窖泥中拜氏梭菌的定量分析

為了進一步驗證拜氏梭菌（）是濃香型白酒發酵過程中正丁醇合成的主要微生物，采用實時熒光定量PCR法對原酒正丁醇含量高中低分類（H、M、L）的3 個窖池窖泥進行的生物量檢測。結果顯示，3 份窖泥樣品中的含量存在顯著性差異，不同窖泥中含量與原酒中正丁醇含量規律一致，即原酒正丁醇含量高的窖池窖泥含量也高，這也進一步證實是參與正丁醇合成的主要微生物。

2.2.3 正丁醇生成途徑解析

根據高級醇兩條經典代謝途徑——氨基酸分解代謝途徑（Ehrlich 途徑）和糖代謝合成途徑（Harris 途徑），參與正丁醇生成的前體物質有糖、有機酸和氨基酸三大類。設計添加試驗比較各類前體物質的貢獻程度，分別選擇3種糖類葡萄糖、麥芽糖和甘油作為前體碳源，3種有機酸乙酸、乳酸和丁酸作為前體有機酸，3種氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸作為前體氨基酸，選擇RCM 為基礎培養基，添加相同量的9種前體物質，考察各前體物質對正丁醇生成的影響。如圖5所示，各類前體物質中對正丁醇生成量影響由高到低分別是丁酸、葡萄糖、乙酸、麥芽糖、谷氨酸、天冬氨酸、甘油、乳酸、蘇氨酸，其中添加丁酸和葡萄糖顯著高于其他前體，丁酸試驗組正丁醇生成量高達1865 mg/100 mL，較對照高出3.4 倍，葡萄糖試驗組正丁醇生成量1668 mg/100 mL，較對照高出3 倍。氨基酸的種類對正丁醇的生成量有較大影響，其中谷氨酸和天冬氨酸對正丁醇的生成有明顯促進作用，添加蘇氨酸生成的丁醇含量與對照相當，可知蘇氨酸不是合成正丁醇的主要底物。綜上，梭菌主要通過糖代謝合成途徑（Harris 途徑）合成正丁醇，其中葡萄糖和丁酸是影響正丁醇產量的最重要的前體物質。

圖5 添加不同前體物質對正丁醇生成的影響

3 結論與展望

本研究以濃香窖內不同位置、不同發酵時間節點的酒醅中正丁醇含量為研究對象，分析了酒醅中正丁醇的生成和分布規律，明確了濃香型白酒4 個生產排次中正丁醇從頭排酒至四排酒逐排下降，循環往復，規律明顯；窖內酒醅中正丁醇主要于發酵中后期14～21 d 之后開始快速生成；靠近窖泥的酒醅中正丁醇含量相對較高，具體表現為黃水＞雙輪底＞回缸＞大米查＞小米查，整體大致呈現“上下高、中間低”的規律，說明與窖泥充分接觸能夠促進正丁醇的生成，窖泥是濃香型白酒中產正丁醇微生物的重要載體。

表2 不同窖泥理化指標與C.beijerinckii含量

針對篩自窖泥的拜氏梭菌、巴布利丁酸梭菌和酪丁酸梭菌等8 株梭菌進行產正丁醇能力評價，結果表明，產丁醇能力最強；以熒光定量PCR 法分析不同窖泥中的生物量，進一步證實是濃香型白酒發酵過程中正丁醇合成的主要微生物；通過設計添加糖、有機酸和氨基酸等三類9 種物質，得知丁酸和葡萄糖試驗組顯著高于其他組，說明了糖代謝合成途徑（Harris途徑）是合成正丁醇的主要途徑。

本研究僅對正丁醇的生成規律和代謝途徑做了初步研究與驗證，尚未涉及產正丁醇梭菌的生長代謝特性、利用微生物擾動調控正丁醇技術的研究，這也是后續工作的重要研究方向。濃香型白酒生產工序繁多、工藝參數匹配復雜，難以用絕對的、統一的工藝參數去調控正丁醇的生成，例如生產過程中入池水分過大，窖內黃水液位升高，窖內提前進入厭氧環境，為具有運動性的產正丁醇梭菌創造空間和時間上的優勢。此外雙輪底留取數量過多，相當于在酒醅入池階段就接種了大量梭菌，進而影響到整個窖內正丁醇的含量，雙輪底自身經過多排次發酵，正丁醇含量會繼續升高，若使用不合理，會將更多的正丁醇富集到原酒中。這需要我們尊重傳統工藝，全面深刻的認識微生物特性及代謝規律，靈活應用到釀酒生產中，科學制定并嚴格執行工藝參數，促進整個窖內發酵系統的良性循環。